综述：红发夫酵母合成虾青素的研究进展与趋势

本文聚焦红发夫酵母（Phaffia rhodozyma）合成虾青素的研究。全面梳理了虾青素生物合成途径、提升产量的生物技术，探讨转录调控及合成影响因素，并对未来研究方向进行展望，为深入了解和优化虾青素生产提供参考。

　　

虾青素概述

虾青素是一种具有强大抗氧化能力的类胡萝卜素，其抗氧化活性比辅酶 Q10、维生素 E 更强，是维生素 C 的 65 倍。它能清除多种有害物，减轻脂质过氧化，抑制相关自由基，还具备抑制肿瘤发生、增强免疫力等多种生理功效，在保健品、医药、化妆品、食品添加剂和水产养殖等领域应用前景广泛。

目前，虾青素主要通过化学合成和微生物发酵获取。化学合成法成本高、副产物多、不环保，且全球监管日益严格；微生物合成的天然虾青素主要来源于雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）和红发夫酵母（Phaffia rhodozyma ，又名 Xanthophyllomyces dendrorhous） 。不同微生物来源的虾青素光学异构体不同，生物活性也略有差异。红发夫酵母虽虾青素含量低于雨生红球藻，但具有繁殖快、培养条件简单、不受天气影响、虾青素易纯化、合成途径和酶系统便于调控等优势。

红发夫酵母中虾青素的生物合成

红发夫酵母中虾青素的合成起始于碳源（如葡萄糖、木糖等）转化为丙酮酸，丙酮酸经糖酵解途径生成乙酰辅酶 A（acetyl-CoA），部分乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环（TCA）产生能量（ATP）和还原力（NADPH）。虾青素的生物合成通过甲羟戊酸途径、异戊二烯生物合成途径和类胡萝卜素合成途径完成。

在甲羟戊酸途径中，乙酰辅酶 A 经一系列酶促反应生成异戊烯焦磷酸（IPP）；IPP 进入异戊二烯生物合成途径，经异构化、缩合等反应生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）；GGPP 进入类胡萝卜素合成途径，在多种酶的催化下，逐步转化为八氢番茄红素、番茄红素、β- 胡萝卜素，最终生成虾青素 。其中，CrtYB 和 CrtS 编码的酶具有双功能，对虾青素合成至关重要。

利用生物技术提高红发夫酵母虾青素产量

1. 随机诱变：随机诱变是提高红发夫酵母虾青素产量的常用方法，通过物理（如紫外线、γ 射线）、化学（如 1 - 甲基 - 3 - 硝基 - 1 - 硝基胍、苯菌灵）或大气和室温等离子体（ARTP）等诱变剂处理酵母细胞，筛选高产突变株。该方法虽能有效提高虾青素产量，但存在突变效率低、突变株遗传稳定性差、生长速率下降等问题 。
2. 代谢工程：代谢工程主要通过检测虾青素生物合成途径中的碳流，优化关键酶基因表达、增强前体合成、削弱竞争途径、平衡辅酶因子（NADPH 和 ATP）供应以及调节 Crt 基因家族酶活性等策略，提高虾青素产量 。例如，过表达 HMGR、CrtE、CrtYB、CrtS 等关键基因可增强前体合成；下调角鲨烯合酶（SQS1）、参与麦角甾醇合成的 CYP61 等竞争途径相关基因，有利于虾青素合成；平衡 NADPH 和 ATP 供应，以及优化 CrtYB、CrtI、CrtS、CrtR 等酶的表达比例，可促进虾青素合成 。
3. 优化发酵条件：发酵条件对红发夫酵母虾青素生物合成影响显著。合适的碳源、氮源、无机盐、生长因子，以及适宜的 pH、温度、溶解氧和补料方式等，都能提高虾青素产量。例如，不同碳源对细胞生长和虾青素积累影响不同，氮源限制在红发夫酵母生长后期有利于虾青素合成，添加某些微量元素和维生素、代谢调节剂也可提高虾青素产量 。此外，采用两阶段 pH 发酵策略、脉冲补料等工艺优化手段，能在一定程度上提高虾青素产量 。
4. 基因组编辑：红发夫酵母的转化系统已得到发展和优化，但传统同源重组技术在研究其代谢途径时存在效率低、不准确的问题。近年来，CRISPR-Cas9 基因组编辑技术取得显著进展，可用于精确修饰虾青素生物合成途径，如敲除竞争途径基因、平衡代谢途径等，为提高虾青素产量提供了新策略 。
5. 其他前沿生物技术：形态和氧化应激工程、代谢工程与传统诱变相结合、基于组学分析的代谢途径调控、蛋白质结构分析等前沿生物技术，也为提高虾青素产量提供了新方向 。例如，通过删除大肠杆菌中与形态 / 膜相关基因和氧化应激相关基因，可提高细胞内活性氧水平，有望增加虾青素产量；基于代谢组学分析添加特定物质，可提高虾青素产量；应用转录组学和蛋白质组学技术，有助于深入理解虾青素合成的调控机制，挖掘新的合成靶点 。

虾青素生物合成的转录调控

1. 固醇调节元件结合蛋白 Sre1 对类胡萝卜素生物合成的调节：固醇调节元件结合蛋白 Sre1 是参与固醇和类胡萝卜素调节的转录因子。在红发夫酵母中，Sre1 通过调节甲羟戊酸途径相关基因表达以及 CrtR 调控范围内的类胡萝卜素前体合成基因，影响虾青素合成 。Sre1 缺陷型突变体与野生型菌株相比，部分与甲羟戊酸和固醇合成途径相关基因表达下调，固醇合成减少，这为在基础氧和固醇水平下组成型激活 SREBP 途径提供了支持 。
2. GATA 转录因子 WCC 对虾青素生物合成的调节：转录因子 WCC 由 WC-1 和 WC-2 蛋白组成，在红发夫酵母中，缺乏 WC 会显著降低 CrtI 和 CrtS 的表达水平，使虾青素水平降低 62%。WCC 通过诱导类胡萝卜素途径中八氢番茄红素去饱和酶（CrtI）和虾青素合酶（CrtS）的表达，影响虾青素合成 。与粗糙脉孢菌不同，红发夫酵母中 WCC 的活性不需要光诱导，其与营养的相关性有待进一步研究 。
3. 分解代谢抑制转录因子 MIG1 对虾青素生物合成的影响：MIG1 作为代谢抑制因子，通过影响葡萄糖的分解代谢抑制，调节红发夫酵母中虾青素的生物合成 。在葡萄糖存在时，MIG1 的缺失会上调 CrtI、CrtYB 和 CrtS 的转录本；而高浓度葡萄糖会诱导 CreA 表达，CreA 结合 DNA 抑制类胡萝卜素途径中番茄红素向 β- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素向虾青素的转化步骤，从而抑制虾青素合成 。研究 CreA 及其调控机制，有助于深入理解红发夫酵母的生长、发育和代谢调控网络 。
4. 损伤反应蛋白 1（Dap1）对类胡萝卜素生物合成的影响：损伤反应蛋白 1（Dap1）在多种生物中通过蛋白质 - 蛋白质相互作用控制细胞色素 P450 酶的活性。在红发夫酵母中，Dap1 与 CrtS 相互作用，通过调节 CrtS 活性和利用 CrtR 作为电子供体，在蛋白质水平上调节类胡萝卜素的产生，尤其是 β- 胡萝卜素向虾青素的转化过程 。Dap1 还与三种特定的 P450 酶相互作用，影响麦角甾醇和虾青素的生物合成过程 。
5. 应激相关转录因子在虾青素合成中的作用：在真菌中，存在多种应激相关转录因子，可响应外界环境和细胞代谢应激，调节特定基因表达，帮助真菌适应环境变化。在红发夫酵母中，ROX1、SKN7、YAP6 等应激相关转录因子参与氧化应激反应、细胞壁生物合成、细胞周期调控等途径，通过调节基因表达和细胞代谢，影响虾青素合成 。这些转录因子与核心抑制复合物 CYC8-TUP1 相互作用，参与基因表达调控，在维持酵母细胞对环境信号的响应和代谢平衡中发挥重要作用 。

促进红发夫酵母虾青素合成的因素

红发夫酵母具有一系列抗氧化防御机制，虾青素本身的高抗氧化能力可帮助细胞抵御自由基和氧化应激损伤 。当细胞面临营养限制（如氮或磷缺乏）、有毒物质存在、呼吸或氮代谢相关基因突变等应激条件时，会触发细胞内氧化还原失衡，进而启动虾青素合成，以保护细胞 。

1. 线粒体呼吸链电子流受损促进虾青素合成：分子氧是线粒体呼吸和氧化磷酸化的重要底物，红发夫酵母在有氧条件下（培养基中氧浓度 > 空气饱和度的 20%）积累虾青素 。氧浓度升高、线粒体呼吸功能下降、NADH/NAD⁺比值增加等，会促进活性氧（ROS）生成，进而促进虾青素合成 。但过高的氧浓度或氧化应激会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡 。一些呼吸链相关基因突变的突变株，其虾青素合成与生长呈现特定关联，在生长早期，由于 NADH/NAD⁺比值增加和氧浓度升高，会促进虾青素合成 。
2. 氧化 ADP 磷酸化受损促进虾青素合成：培养基中氮源的种类和浓度对微生物类胡萝卜素合成影响关键。在红发夫酵母中，低氮浓度培养时，细胞内虾青素和其他类胡萝卜素积累增加 。氮限制会影响有氧呼吸中 NADH 的再氧化，导致呼吸受损、NADH/NAD⁺比值升高和培养基中氧浓度增加，进而促进 ROS 生成和虾青素积累 。同时，氮限制会抑制蛋白质合成，影响细胞代谢 。无机磷和镁是细胞代谢必需的营养物质，缺乏会影响 ATP 磷酸化、氧化磷酸化和 TCA 循环，导致 NADH/NAD⁺比值和氧浓度升高，促进虾青素合成，但也会影响细胞生长 。
3. 导致 NADH 过量的条件促进虾青素合成：多种诱导红发夫酵母虾青素积累的机制与 NADH 再氧化受阻有关。在高糖浓度下，红发夫酵母产生乙醇，当糖耗尽后利用乙醇作为碳源时，NADH/NAD⁺比值增加，触发细胞氧化应激，影响虾青素合成 。高糖本身也会影响虾青素合成，尽管转录因子参与葡萄糖依赖的抑制作用，但在高糖条件下虾青素合成仍能进行，且高糖会刺激 ROS 产生，进而影响虾青素合成 。

展望

类胡萝卜素广泛存在于微生物中，除虾青素外，还有其他具有抗氧化活性的类胡萝卜素 。过去几十年，许多酵母被研究用于生产类胡萝卜素，其中红发夫酵母最为常见 。随着合成生物学发展，大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等也被改造用于生产类胡萝卜素，但存在安全性、菌株稳定性和发酵时间长等问题 。此外，红酵母属的一些菌株也具有生产萜类化合物的潜力，且新发现的红发夫酵母菌株可能具有更高的虾青素生产能力 。

目前，虽在红发夫酵母虾青素生物合成研究方面取得进展，但仍面临挑战。其代谢网络复杂，受代谢化学计量限制，单一基因或少数基因的改变对提高虾青素产量效果有限 。要显著提高产量，需全面理解代谢网络，协调操纵多个基因或调控元件，可通过引入异源途径基因扩展宿主代谢网络 。借助高质量的跨物种代谢网络模型（CSMN）和定量异源途径设计算法（QHEPath），以及机器学习算法、代谢网络模型分析工具（如 CAVE）等，有望实现虾青素合成与细胞代谢的平衡，提高虾青素产量，快速构建高产虾青素的红发夫酵母菌株 。