解开非同源末端连接中 Ku70/80 与 Pol X 家族聚合酶互作之谜

非同源末端连接（NHEJ）是哺乳动物双链 DNA 断裂（DSBs）的主要修复途径。为探究其中 Pol X 家族聚合酶与相关复合物的互作机制，研究人员解析了相关冷冻电镜结构并进行功能分析。结果明确了互作位点及关键残基，提出统一模型，为理解 NHEJ 机制提供重要依据。文章发表在《Nature Communications》上。

　　

在生命的微观世界里，DNA 就像一本记录着生命密码的珍贵书籍，然而，外界的各种因素却时不时地给这本 “书” 制造麻烦，导致双链 DNA 断裂（DSBs）。非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）作为哺乳动物细胞中修复 DSBs 的主要途径，一直备受科学家们的关注。在这个复杂的修复过程中，有一群关键 “角色”——Pol X 家族的 DNA 聚合酶 λ（Pol λ）和 μ（Pol μ），它们在 NHEJ 中发挥着重要作用。但是，它们在 NHEJ 复合物中的相互作用却如同隐藏在迷雾之中，模糊不清。为了揭开这层迷雾，来自法国图卢兹的保罗?萨巴蒂埃大学（Université Toulouse III—Paul Sabatier）、英国莱斯特大学（University of Leicester）等机构的研究人员展开了深入研究。

研究人员通过一系列实验，获得了重要的研究成果，并将其发表在《Nature Communications》上。这一研究对于深入理解 NHEJ 的分子机制、完善 DNA 损伤修复理论具有重要意义，也为未来开发针对相关疾病的治疗策略提供了潜在的靶点和理论基础。

为了深入探究 Pol X 家族聚合酶与 NHEJ 复合物的相互作用机制，研究人员主要运用了冷冻电镜技术（cryo-EM）和细胞实验技术。利用冷冻电镜技术，研究人员解析了 Pol λ 与 DNA-PK 长程突触复合物以及 Pol μ 与 Ku70/80 - DNA 结合的结构；通过细胞实验，包括细胞转染、激光微辐射实验等，研究人员对蛋白互作的功能进行了验证 。

研究结果

1. Pol λ 与 Ku80 介导的 DNA-PK 二聚体的冷冻电镜结构：研究人员首先表达并纯化相关蛋白，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）证实了纯化的聚合酶能与 Ku70/80 相互作用。在解析 Pol λ 与相关复合物的冷冻电镜结构时发现，只有 Pol λ 的 BRCT 结构域能被建模到冷冻电镜图中，这表明在确定的冷冻电镜组装中，催化结构域与 DNA 没有稳定的相互作用。

2. Pol λ 的 BRCT 结构域与 Ku70/80 相互作用的分子基础：Pol λ 的 BRCT 结构域位于 Ku70 和 Ku80 形成的界面处，其 α1 螺旋能嵌入 Ku70 和 Ku80 之间的凹槽。研究发现，Pol λ BRCT 结构域的精氨酸 57（Arg57）和亮氨酸 60（Leu60）等残基介导了与 Ku70/80 的接触，而 Ku70/80 上的一些特定残基也参与了相互作用。

3. Pol λ:Ku 界面关键残基对 Pol λ BRCT 在核激光损伤位点招募的影响：通过对 U2OS 细胞进行激光微辐射实验，研究人员发现全长 Pol λ 向损伤位点的招募部分依赖于 Ku，而 N 端 Pol λ BRCT 结构域的招募大多依赖于 Ku。此外，Pol λ BRCT 结构域的突变会损害其向激光诱导的 DNA 损伤位点的积累，Ku70/80 上的一些突变也会影响 Pol λ 的招募 。

4. 细胞中缺口填充试验的建立：研究人员设计了一种基于 Cpf1 诱导的缺口填充依赖的 DNA 修复报告质粒，转染 HEK - 293T 细胞后，通过流式细胞术检测荧光蛋白的表达来评估缺口填充活性。实验证实该报告系统依赖于 NHEJ 活性，且 Pol λ 在缺口填充活性中起主导作用。

5. Pol λ 依赖的缺口填充活性依赖于 Pol λ BRCT:Ku 界面的关键位置：利用上述缺口填充试验，研究人员分析了 Pol λ BRCT 突变对缺口填充效率的影响，发现除 R96A 外，其他突变均降低了缺口填充效率。同时，研究还评估了 Ku70 和 Ku80 突变对缺口填充和直接末端连接的影响，确定了一些关键位置 。

6. Pol μ 与 Ku70/80 在桥接处结合：研究人员对 Pol μ 进行研究，通过简化系统获得了其与 Ku70/80 结合的冷冻电镜结构，发现 Pol μ 的 BRCT 结构域与 Ku70/80 的结合方向与 Pol λ 不同，但 Ku80 E304 和 Ku70 F303 同样是关键位置。通过对 Pol μ BRCT 突变的功能分析，验证了 R43 位置对 Pol μ 在 NHEJ 中的活性至关重要。

7. Pol λ 和 Pol μ 与 Ku70/80 的结合确保细胞对电离辐射（IR）的存活：研究人员评估了破坏 PolX:Ku 相互作用对细胞辐射敏感性的影响，发现 Ku70 F303G 突变体影响细胞对辐射的抗性，Pol λ 和 Pol μ 在缺口填充活性上存在部分补偿，且相关突变会影响细胞对辐射的存活能力。

研究结论与讨论

研究人员通过解析冷冻电镜结构和进行功能分析，明确了 Pol λ 和 Pol μ 与 Ku70/80 相互作用的结构基础和功能意义。确定了 BRCT 结构域在招募 Pol λ 到 NHEJ 复合物中的关键作用，以及 Ku70/80 和 Pol λ - BRCT 上介导相互作用的关键位置。研究还发现 Pol X 家族成员可能通过相似的蛋白 - 蛋白界面与 Ku70/80 相互作用，这为提出统一模型提供了依据。

这一研究揭示了 Ku70/80 与 Pol X 家族聚合酶相互作用的新模式，丰富了人们对 NHEJ 机制的理解。Ku70/80 作为 NHEJ 机制中的核心结构枢纽，其与不同蛋白的相互作用位点的明确，有助于进一步解析 NHEJ 过程的精细调控机制。同时，研究结果也为后续研究 DNA 损伤修复相关疾病的发病机制和治疗策略提供了重要的理论基础，具有广阔的应用前景。