进化引导蛋白质设计：IscB 实现体内持久表观基因组编辑的突破

在分子技术中，优化酶的功能面临挑战，为解决现有基因组编辑工具活性与特异性难以平衡及体内递送困难等问题，研究人员开展 IscB 蛋白工程研究。他们构建出 NovaIscB，可用于体内持久基因抑制，为分子生物学应用提供了更优工具。

　　在生命科学领域，基因组编辑技术的发展为研究和治疗复杂疾病带来了新的希望。其中，RNA 引导的系统，如广为人知的 CRISPR-Cas9 系统，极大地推动了遗传筛查、疾病模型构建以及临床治疗等方面的进展。然而，随着研究的深入，现有的基因组编辑工具暴露出一些亟待解决的问题。一方面，在优化编辑效率的过程中，如何平衡活性与特异性成为了一个难题。增强活性往往伴随着特异性的降低，这使得编辑工具在体内应用时可能会出现脱靶效应，对正常基因组造成损伤，限制了其在临床治疗中的安全性和有效性。另一方面，许多编辑工具由于尺寸较大，难以通过常规的载体进行高效的体内递送，尤其是那些融合了其他功能域的工具，如转录激活剂和抑制剂，构建体过大导致递送挑战加剧。

为了突破这些瓶颈，来自国外（Howard Hughes Medical Institute、Broad Institute of MIT and Harvard 等多个机构）的研究人员开展了一项关于 IscB 蛋白工程的研究。他们致力于通过一系列创新策略，优化 IscB 蛋白及其引导 RNA（ωRNA）的功能，期望能够开发出一种高效、特异性强且便于体内递送的基因组编辑工具。

经过深入研究，研究人员取得了一系列令人瞩目的成果。他们成功构建出了优化的紧凑型 IscB——NovaIscB。NovaIscB 在人类基因组编辑中展现出卓越的性能，其插入缺失（indel）活性相较于野生型 OgeuIscB 提高了约 100 倍，最高可达 40%，同时特异性也得到了显著提升。此外，研究人员将 NovaIscB 与甲基转移酶融合，创建了可编程的转录抑制因子 OMEGAoff。OMEGAoff 足够紧凑，可以包装在单个腺相关病毒（AAV）载体中，实现了体内持久的基因抑制，为表观基因组编辑带来了新的突破。这一研究成果发表在《Nature Biotechnology》上，为基因组编辑领域的发展提供了重要的理论和实践基础。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是大规模的直系同源筛选，他们从众多 IscB 直系同源物中筛选出具有潜在基因组编辑活性的蛋白。其次，利用结构引导的蛋白质设计和理性的 RNA 工程技术，对筛选出的蛋白和 ωRNA 进行优化。另外，借助深度学习结构预测技术，辅助蛋白结构的分析和设计。在验证编辑效果时，采用了细胞培养和转染实验、体外转录 - 翻译（IVTT）实验以及体内实验等多种实验手段。

下面详细介绍研究结果：

1. 筛选天然 IscB 变体作为高效基因组编辑器：研究人员对大量 IscB 直系同源物和部分 Cas9 同源物进行筛选。通过 IVTT TAM 筛选和细胞实验，先后确定了多个具有潜在人类基因组编辑活性的蛋白，如 OgeuIscB、TbaIscB 等。其中，OrufIscB 表现出较高的 indel 率，且有效引导长度为 14 - 15nt，相对较短。研究人员认为提高其有效引导长度可能改善特异性，进而对其进行后续工程改造。
2. 进化引导的 OrufIscB 重新设计以实现高效编辑：基于对 IscB 和 Cas9 结构进化的分析，研究人员将 REC 和 REC 样结构域插入到野生型 OrufIscB 中。通过 AlphaFold2 建模确定插入位点，构建并测试了多个 OrufIscB - REC 嵌合体。筛选出的 OrufIscB - REC 变体在体外和细胞实验中均表现出增强的活性，且有效引导长度有所增加。随后，通过理性诱变进一步优化 OrufIscB - REC，获得了活性更高的 OrufIscB - KRK 变体，但该变体特异性有所下降。
3. 优化 REC 结构域双链识别以获得 NovaIscB：为提高特异性，研究人员对 OrufIscB - REC 进行优化，通过交换 REC 结构域中的环来改善与引导 - 靶标异源双链的相互作用。构建并测试了多个变体，最终确定了 NovaIscB（组合 12）。NovaIscB 在保持高活性的同时，显著提高了特异性，有效引导长度增加到 16nt，接近 SpCas9 的体外有效引导长度。与其他紧凑型基因组编辑器相比，NovaIscB 在活性和特异性方面表现更优。
4. 结构引导的 OrufIscB ωRNA 工程：研究人员对 OrufIscB ωRNA 进行工程改造，通过逐步截断 3′端和 5′端的非结构化区域，成功缩短了 ωRNA 的长度，减少了 59nt，同时提高了其在细胞中的表达水平。此外，还开发了一种条件激活开关，通过分裂 ωRNA 的发夹结构，实现了对 IscB 功能的可控激活。
5. OrufIscB 是一种多功能基因组检测工具：NovaIscB 及其 ωRNA 变体的紧凑尺寸使其能够与融合结构域和 ωRNA 表达盒一起包装在单个 AAV 基因组中。研究人员测试了 OrufIscB 与碱基编辑和靶向甲基化的兼容性，开发了基于 OrufIscB 的表观基因组编辑和转录抑制系统 OMEGAoff，以及基因激活系统 OMEGAon。OMEGAoff 在细胞和体内实验中均表现出强大的基因抑制能力，且具有良好的稳定性和特异性。
6. 体内表观基因组编辑与 NovaIscB：研究人员将 OMEGAoff 应用于体内实验，通过 AAV 载体将其递送至小鼠肝脏，靶向 PCSK9 基因。结果显示，注射 OMEGAoff 的小鼠血清中 PCSK9 蛋白和胆固醇水平显著降低，且在 6 个月的观察期内持续有效，同时未观察到明显的毒性反应。这表明 OMEGAoff 在体内持久基因抑制和表观基因组编辑方面具有巨大的潜力。

研究结论和讨论部分强调了该研究的重要意义。研究人员通过结合多种工程策略，成功开发出 NovaIscB 这一优化的紧凑型 IscB，并将其应用于创建紧凑型表观基因组编辑器 OMEGAoff。与以往的研究相比，NovaIscB 在活性和特异性方面实现了更好的平衡，为基因组编辑提供了更强大的工具。OMEGAoff 能够通过 AAV 载体实现体内稳定的表观遗传修饰和靶向转录抑制，为治疗相关疾病提供了新的策略。尽管 NovaIscB 的 TAM（靶标相邻基序）存在一定限制，但研究人员已经展示了通过突变 TAM 相互作用残基来扩展其靶向范围的潜力。未来，进一步优化 NovaIscB 的 TAM 要求以及融合其他功能域，有望使其在基因组编辑领域发挥更大的作用，为生命科学研究和临床治疗带来更多突破。