编辑推荐：
在基因表达分析中，合适的参考基因至关重要。研究人员针对番石榴（Psidium guajava L.）开展稳定参考基因的筛选研究。通过对 10 个管家基因分析，发现 PgTUB1、PgEF1a和 PgEF2 稳定性较高，可作为理想参考基因，为番石榴基因表达研究提供重要依据。
在生命科学的基因研究领域，定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）是研究基因表达水平的重要技术。它凭借高灵敏度、特异性、准确性以及高通量分析能力，在科研中广泛应用。然而，该技术的可靠结果依赖众多因素，其中选择稳定的参考基因进行数据归一化处理尤为关键。因为参考基因就像一把精准的 “尺子”，只有它稳定，才能准确衡量目标基因的表达水平。但现实情况是，并没有一个通用的、在所有条件下都稳定表达的参考基因。不同植物物种，甚至同一物种的不同组织，基因表达稳定性都可能不同。例如在番茄中，部分管家基因在不同叶期和芽大小阶段表达并不稳定。若使用不稳定的基因作为参考基因，会导致基因表达水平的高估或低估，进而影响研究结果的准确性。所以，为特定作物找到稳定的参考基因成为科研人员亟待解决的重要问题。
为了解决这一难题，来自印度农业研究委员会 - 亚热带园艺中央研究所（ICAR-Central Institute for Subtropical Horticulture）的研究人员开展了关于番石榴（Psidium guajava L.）稳定参考基因筛选与验证的研究。他们的研究成果发表在《Electronic Journal of Biotechnology》上，为番石榴基因表达研究提供了关键参考。
研究人员运用了多种关键技术方法。首先是 RNA 提取及相关处理，从番石榴不同组织中提取总 RNA，并进行质量控制、定量和 cDNA 合成。然后，通过挖掘番石榴基因组中的管家基因，利用 Primer3Plus 软件设计 qRT-PCR 引物。最后，运用 qRT-PCR 技术进行基因表达分析，并使用多种方法评估基因表达稳定性，包括 GeNorm、NormFinder、BestKeeper、比较 ΔCt 法、RefFinder 和稳定性指数分析。
研究结果主要包含以下几个方面：
- PCR 优化和引物效率评估：研究人员对 10 个管家基因进行 PCR 优化，发现各引物均能扩增出单一目标片段，且 qRT-PCR 的扩增曲线和熔解曲线良好，无特异性扩增。引物对的相关性系数超 0.98，扩增效率在 74.353% - 124.9% 之间，表明引物可有效扩增目标基因。
- 候选管家基因在不同组织中的表达水平：通过 qRT-PCR 分析不同组织中候选基因的表达，发现 PgACT 表达水平最高，PgPOLX1 最低。从 Ct 值变化来看，PgTUB 和 PgEF1G 表达较稳定，PgRBP47 和 PgPOLX1 表达变化较大，不过仅依据这些还不能直接确定理想参考基因。
- 评估基因表达稳定性以选择理想参考基因：运用 6 种方法评估 10 个管家基因的表达稳定性，结果显示不同方法下基因稳定性排序有差异。综合比较，PgTUB1、PgEF1a和 PgEF2 在多种方法评估中均排名靠前，是最稳定的参考基因；PgRBP47 在所有方法中都表现为最不稳定，不适合作为参考基因；PgPOLX1 和 PgACT 稳定性中等，可在一定程度上作为参考基因。
在研究结论和讨论部分，研究人员明确指出 PgTUB1、PgEF1a和 PgEF2 是番石榴基因表达研究中数据归一化的理想参考基因。这一结论意义重大，为后续番石榴基因功能研究、基因表达调控机制探索等提供了可靠的标准化基础。同时，该研究也展示了不同基因稳定性分析工具在筛选理想参考基因中的作用，为其他科研人员在相关研究中选择合适的分析方法提供了参考。此外，研究还对不稳定基因如 PgRBP47 进行了探讨，其不稳定的原因与自身功能特性相关，它参与 mRNA 的成熟过程，在植物应对多种胁迫时发挥作用，所以表达变化较大。而稳定的参考基因如 PgTUB1，作为微管蛋白的组成部分，在维持细胞基本功能中不可或缺，其序列保守，表达稳定；PgEF1a和 PgEF2 参与蛋白质合成，是细胞重要的翻译机制，稳定表达保障了细胞的正常生理活动。这些发现不仅加深了对番石榴基因表达调控的理解，也为其他植物参考基因筛选研究提供了借鉴，推动了植物基因表达分析领域的发展。
