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引导编辑（prime editing）效率和纯度存在局限，会产生非预期编辑结果。研究人员开展了双重抑制 DNA-PK 和 Pol?对多种引导编辑系统影响的研究。结果表明该策略能提升编辑精准度，减少脱靶编辑。这为优化引导编辑系统提供了新方向。
在基因编辑的奇妙世界里，引导编辑（prime editing）就像一把神奇的 “基因剪刀”，理论上能够高精度地对基因组进行各种小的修改，如插入、删除和替换特定的基因片段。这一技术在疾病建模和潜在的基因治疗领域，有着巨大的潜力，就像为破解基因密码、治疗疑难病症提供了一把关键钥匙。然而，理想很丰满，现实却很骨感。引导编辑目前面临着诸多挑战，其效率和纯度在不同的编辑类型、基因组靶点以及细胞类型中差异很大，而且常常会出现意想不到的 “小插曲”—— 非预期的编辑结果，像是插入或缺失（indels）错误的基因片段，或者进行了不精确的引导编辑。特别是在一些为了提高效率而设计的复杂系统中，如使用第二个切口导向 RNA（nicking gRNA）的 PE3 和 PE5 系统，双 pegRNA 系统，以及基于野生型、完全活性核酸酶的 PEn 系统，这些问题变得更加突出，就好比一辆在高速行驶中却方向失控的汽车，大大限制了引导编辑技术的广泛应用。
为了攻克这些难题，让引导编辑这把 “基因剪刀” 更加精准、好用，来自阿斯利康（AstraZeneca）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一项关于双重抑制 DNA 依赖蛋白激酶（DNA-PK）和 DNA 聚合酶 ?（Pol?）对多种引导编辑系统影响的研究。最终，他们发现通过这种双重抑制的策略，能够显著提升 PEn、PE3、PE5、PE7 以及双 pegRNA 编辑系统（包括 TwinPE、HOPE 和 Bi-PE）在多个基因组位点和编辑类型中的精准度，减少非预期的编辑产物，还能降低 PEn 的脱靶编辑。这一成果发表在《Nature Communications》上，为引导编辑技术的优化和发展带来了新的曙光。
研究人员在此次研究中，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，他们培养了多种细胞系，如 HEK293T、HeLa、HepG2 等，并对这些细胞进行转染操作。在基因分析层面，采用了基因组 DNA 提取、扩增子测序技术，获取编辑后的基因信息。借助生物信息学分析工具，如 bcl2fastq 软件和 CRISPResso2 V2.2.12，对测序数据进行处理和解读，从而了解编辑结果。
共抑制 DNA-PK 和 Pol?提高 PEn 编辑的精准度
PEn 编辑由于其使用的完全活性 Cas9 核酸酶，通常会产生较高水平的 indels。研究人员以在 HEK293T 细胞的 KCNA1 位点安装点突变为模型，测试不同组合的 DNA-PK 和 Pol?抑制剂对 PEn 编辑的影响。通过靶向扩增子测序发现，与单独使用 PEn 相比，同时抑制 DNA-PK 和 Pol?能进一步减少 indels，提高编辑精准度。在多个位点和不同细胞系（HEK293T 和 HeLa）的实验中，这一效果得到了验证，2+iPEn 组合甚至能实现接近完全的编辑纯度，同时保持 PEn 的高效编辑能力。
共抑制 DNA-PK 和 Pol?减少 PEn 脱靶编辑
PEn 使用混杂的 pegRNAs 时，脱靶编辑会增加。研究人员针对 4 个 promiscuous pegRNAs 及其对应的 13 个脱靶位点进行系统研究。结果显示，2iPEn 和 2+iPEn 能显著减少脱靶编辑，2+iPEn 平均降低脱靶编辑达 27.9 倍。通过计算特异性得分也证实，这两种组合相较于 PEn，脱靶编辑明显减少。
共抑制 DNA-PK 和 Pol?提高 nickase - 基于的引导编辑系统在不同细胞类型中的精准度
PE3 和 PE5 因第二个 DNA 切口靠近靶位点，会诱导较高水平的 indels。研究人员在 HEK293T 和 HeLa 细胞的 PCSK9 位点插入 11bp 片段，测试不同药物组合对 PE2、PE3、PE4 和 PE5 编辑的影响。结果表明，DNA-PK 和 Pol?共抑制对 PE2 和 PE4 编辑精准度无影响，但显著提高了 PE3 和 PE5 的编辑精准度，减少了不精确的引导编辑副产物和 indels。在 PE7 系统中，共抑制同样减少了因 ngRNA 增加导致的 indels。在多种细胞类型（如 HepG2、Huh7、K562、iPSCs 和 PHHs）中，这一策略也普遍减少了 indel 的形成。
共抑制 DNA-PK 和 Pol?提高双 pegRNA 引导编辑系统的精准度
双 pegRNA 编辑系统常因双切割性质导致不想要的 indels。研究人员在 TwinPE、HOPE 和 Bi-PE 等系统中应用 DNA-PK 和 Pol?共抑制策略。以 TwinPE 在 AAVS1、ACTB 和 CCR5 位点替换基因组序列为例，共抑制显著减少了 indels，同时保持了精确替换的效率。在 HOPE 和 Bi-PE 系统中，也观察到类似的结果，证明该策略可用于提高双 pegRNA 编辑系统的精准度。
在讨论部分，研究人员指出引导编辑虽有优势，但效率和精准度问题限制了其发展。他们使用 DNA-PK 和 Pol?的小分子抑制剂，成功提高了多种引导编辑系统的精准度。这一策略 “2iPE” 可广泛应用于不同的引导编辑系统，在保持高效编辑的同时，实现近乎完全的精确编辑纯度，还对减少脱靶编辑有积极作用。此外，研究还发现 2iPE 与之前用于同源定向修复（HDR）的策略机制有所不同，在 HDR 中，抑制 DNA-PK 和 Pol?可提高模板整合效率，而在引导编辑中，主要是减少副产物，对精确编辑效率影响不大，这可能与两种修复机制依赖的模板特性以及细胞周期的关系不同有关。
总的来说，这项研究为引导编辑技术的优化提供了重要的理论和实践依据。通过双重抑制 DNA-PK 和 Pol?，研究人员找到了提高引导编辑精准度的有效方法，这不仅有助于推动疾病建模和基因治疗等领域的发展，还为后续进一步优化引导编辑系统指明了方向，让人们在基因编辑的道路上又向前迈进了坚实的一步。
