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人乳寡糖（HMOs）临床测试受限，且混合物对健康更有益。研究人员以双歧杆菌长亚种的乳糖N- 二糖苷酶 LnbX 为对象，经蛋白工程改造和反应条件优化，使对para- 乳糖N- 己糖（pLNH）合成产率提升超 3 倍，为 HMOs 工业化生产助力。
在生命科学领域，人乳寡糖（HMOs）因其独特的生理功能备受关注。HMOs 存在于母乳中，对婴儿的生长发育和健康起着重要作用，比如调节肠道菌群、增强免疫力等。然而，目前 HMOs 的临床测试面临着诸多挑战，主要原因在于其获取途径有限，难以大量获得用于研究。而且，现有的研究数据表明，HMOs 的混合物对人体健康的积极影响似乎比单一 HMOs 更为显著，这意味着需要开发出更多种类的 HMOs，使其更接近母乳的成分。此外，一些研究还发现，较长链的 HMOs 可能具有更强的抗菌效果，这进一步凸显了拓展 HMOs 种类的重要性。
为了解决这些问题，来自国外的研究人员开展了一项针对 HMOs 合成的研究。他们聚焦于利用酶法合成 HMOs，通过对特定酶的改造和反应条件的优化，期望提高目标 HMOs 的产量。研究成果发表在《Enzyme and Microbial Technology》杂志上。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先是蛋白工程技术，通过定点突变构建 LnbX 突变体；其次运用多种酶活性检测方法，如水解和转糖基化活性测定；还使用了高效液相色谱 - 带电气溶胶检测（HILIC-CAD）、核磁共振（NMR）、多孔石墨化碳液相色谱 - 质谱联用（PGC-LC-MS）等分析技术，对反应产物进行分离、鉴定和定量分析；另外，运用中心复合设计（CCD）优化反应条件。
下面来看具体的研究结果：
- 重组 LnbX 的制备：在大肠杆菌中成功表达并纯化出重组 LnbX，其产量可达每升培养物 15 - 16mg。表达 LnbX 需要其伴侣蛋白 LnbY 的共同表达，研究人员尝试构建 LnbX - LnbY 融合蛋白，发现 N 端为 LnbX 的融合蛋白保留了 71 - 74% 传统共表达 LnbX 的活性，C 端为 LnbX 的融合蛋白活性较低，且酶切后活性也无法完全恢复，后续实验采用传统共表达方式。
- 生化特性表征：通过热变性、构象稳定性和长期储存稳定性分析，确定 pH 5.0 - 6.0、40°C 利于酶稳定和催化，4°C 和 - 80°C 储存 8 个月的 LnbX D416N 转糖基化活性无显著差异。
- pLNH 的合成反应：首次发现 LnbX 可催化 LNT 和 LNnT 合成 pLNH，反应 1h 时 pLNH 产率最高达 18.5% ，之后因二次水解而下降。pH 6.0 时转糖基化与水解速率比值更高，后续实验在此条件下进行。
- LnbX 工程改造提升转糖基化产率：设计 14 个单突变体，包括保守位点突变和引入大的疏水残基屏蔽活性位点。D416N 和 M439L 突变体转糖基化产率显著高于野生型，分别达 27% 和 23% ；G410W 突变体产率为 24% 且二次水解减少，但部分突变体组合导致酶失活或产率剧降，最终选择 D416N 进行后续优化。
- 转糖基化产率的优化：利用 CCD 对 D416N 反应条件优化，发现 LNT 浓度、A/D 比和酶浓度显著影响 pLNH 产率。优化后最高产率达 57% ，优于此前非优化条件，且该酶可利用工业规模的 LNT 和 LNnT 为底物，优势明显。
- 修饰供体和受体底物的转糖基化反应：LnbX D416N 对某些修饰底物无活性，但可催化 LNFP - III 与 LNT 反应生成七糖产物，产率为 17%。
研究结论和讨论部分指出，通过蛋白工程和反应条件优化，pLNH 产率提升超 3 倍。保守位点突变可提高转糖基化效率，引入疏水残基屏蔽活性位点虽产率不如前者，但也是可行策略。优化反应条件可提高产率和选择性。LnbX 及其变体 LnbX D416N 在工业相关条件下稳定，有望用于 HMOs 多样化生产，为未来 HMOs 的工业化合成和应用开辟了新途径，有助于推动相关领域的发展，如婴儿配方奶粉的优化等，具有重要的理论和实践意义。
