新型工程化加帽酶的制备、酶活分析及其在 mRNA 疫苗开发中的意义

目前 mRNA 酶促加帽法存在诸多问题，研究人员设计工程化融合加帽酶（DDGSV）。实验显示，其加帽效率达 80.19% ，和商业加帽酶性能相当，且制备的 GFP mRNA 在 HEK 293T 细胞中高表达，为 mRNA 疫苗开发提供新途径。

　　在现代医学研究领域，mRNA 疗法自 1961 年 mRNA 被发现后，便迅速在肿瘤、传染病和罕见病等研究中崭露头角。mRNA 的制备过程复杂，其中 5’端加帽对 mRNA 的稳定性、翻译效率以及降低免疫原性起着关键作用。加帽结构主要有 Cap0（m⁷Gppp-N mRNA）和 Cap1（m⁷Gppp-Nm mRNA），Cap1 能保护 mRNA 不被 5’外切核酸酶降解、介导前体 mRNA 剪接并降低免疫原性，还能被翻译起始因子 eIF4E 识别从而启动翻译。

在 mRNA 体外转录（IVT）的加帽策略中，酶促加帽和共转录加帽是两种主要方式。酶促加帽需使用痘苗加帽酶（VCE）和 mRNA 2’-O - 甲基转移酶（VP39），VCE 由 D1R 和 D12L 两个亚基组成，D1R 具有 RNA 三磷酸酶（TPase）、鸟苷酸转移酶（GTase）和鸟嘌呤 - N⁷- 甲基转移酶（MTase）三种酶活性，加帽过程繁琐，这增加了 mRNA 疫苗纯化和质量控制的复杂性。共转录加帽虽能减少纯化步骤，但使用商业 Cap1 帽类似物存在专利障碍。因此，寻找一种更高效、低成本且简单的加帽方法迫在眉睫。

为解决这些问题，来自未知研究机构的研究人员开展了一项关于工程化融合加帽酶的研究。他们通过柔性（GGGGS）₃接头将 VCE 和 VP39 连接，构建了工程化融合加帽酶（D1R-D12L-GS linker-VP39，DDGSV），并对其进行了深入研究。该研究成果发表在《Enzyme and Microbial Technology》上，为 mRNA 疫苗开发开辟了新方向。

研究人员在这项研究中使用了多种关键技术方法。首先，利用 AlphaFold2 在线软件预测蛋白质三维结构，从蛋白质数据库下载传统加帽酶的已发表结构，并用 PyMOL 软件进行结构叠加和比较，以此评估预测结构表达的可行性。其次，通过大肠杆菌表达并纯化 DDGSV。之后，运用 LC-MS 评估加帽效率，采用 1% 琼脂糖凝胶电泳评估加帽后 mRNA 的完整性，利用 RNA 斑点印迹探索检测 mRNA 加帽效率的可能性，还借助 HEK 293T 细胞评估翻译活性。

下面来看具体的研究结果：

• 结构预测和重叠比较：研究利用 AlphaFold2 预测 DDGSV 的三级结构，发现其与已发表的 VCE 和 VP39 结构契合良好，表明融合结构未对酶活性位点产生空间位阻，从结构层面验证了工程化加帽酶设计的合理性。
• 细菌表达和纯化：成功构建表达载体 pTolo-EX2-DDGSV，并在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中表达。制备的加帽酶 mRNA 在琼脂糖凝胶上显示出良好的完整性，说明表达和纯化过程未对 mRNA 造成明显损伤，保证了后续实验的可靠性。
• 加帽效率评估：经过 2 小时的加帽反应，工程化酶 DDGSV 的加帽效率达到 80.19%，与商业加帽酶性能相当，这一结果证明了 DDGSV 在实际加帽应用中的高效性，为其替代传统加帽酶提供了有力的数据支持。
• 检测方法探索：研究探索了 RNA 斑点印迹用于快速检测 mRNA 加帽效率的潜力，但也指出还需要定量方法进一步完善检测体系，这为后续研究 mRNA 加帽效率检测提供了新的思路和方向。
• 细胞实验验证：使用 DDGSV 制备的 GFP mRNA 在 HEK 293T 细胞中表现出高表达水平，这表明经 DDGSV 加帽的 mRNA 能够在细胞内有效翻译，进一步验证了工程化加帽酶的功能，为其在 mRNA 疫苗开发中的应用提供了细胞水平的证据。

综合研究结果和讨论部分，该研究成功设计并制备了工程化融合加帽酶 DDGSV，它在加帽效率上与商业加帽酶相当，且能有效促进 mRNA 在细胞内的表达。这一成果不仅降低了 mRNA 加帽过程中的原料成本、简化了工艺复杂度，还减少了杂质的产生，为 mRNA 疫苗的开发提供了一种创新且可行的方法，有望推动 mRNA 疫苗领域的进一步发展，提高疫苗的生产效率和质量，为全球健康事业带来新的希望。