编辑推荐：
为解决角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）治疗难题，研究人员探究角膜缘植块传代对在人羊膜（hAM）上培养的角膜缘上皮干细胞（LESCs）表型的影响。结果发现传代改变细胞特性，或增强干细胞群。该研究为 LSCD 治疗提供新思路。
在眼科领域，角膜上皮细胞的稳定对维持眼睛的透明和良好视觉功能至关重要。而这一切的背后，角膜缘上皮干细胞（Limbal Epithelial Stem Cells，LESCs）功不可没，它们静静待在角膜缘上皮的基底层，时刻准备为角膜上皮的再生贡献力量。可当眼部遭遇化学烧伤、热烧伤等严重状况时，LESCs 就会 “受伤”，无法正常工作，进而引发角膜缘干细胞缺乏症（Limbal Stem Cell Deficiency，LSCD）。LSCD 患者的眼睛会反复出现上皮糜烂，结膜组织还会 “跑” 到不该去的地方，血管也异常生长，严重影响视力，给患者带来极大痛苦。
目前，利用组织工程技术在体外扩增 LESCs 并移植到受损眼表，被视为治疗 LSCD 最有希望的方法之一。其中，人羊膜（human Amniotic Membrane，hAM）凭借其能模拟细胞天然微环境的优势，成为培养 LESCs 的优质 “土壤”。不过，从少量活检组织中获取大量细胞的常用方法 —— 传代，却存在一些问题。它可能会让细胞的特性发生改变，还会降低干细胞的扩增能力和自我更新潜力。在这样的背景下，为了找到更有效的 LSCD 治疗方案，来自多库兹埃尤尔大学（Dokuz Eylül University）的研究人员展开了一项关键研究，他们聚焦于角膜缘植块传代对在 hAM 上培养的 LESCs 表型的影响，相关成果发表在《Experimental Eye Research》上。
研究人员开展此项研究时，采用了多种关键技术方法。首先，在获取样本方面，他们在体外进行实验，且所有操作都经过当地（多库兹埃尤尔大学）伦理委员会批准（批准号：47/2011） ，严格遵循《赫尔辛基宣言》和《ARVO 动物研究使用声明》的伦理原则。其次，在细胞计数环节，他们利用血细胞计数器对不同传代培养 12 天后的细胞进行计数；最后，通过免疫细胞化学和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）来检测与 LESCs 相关的标记物（ABCG2、P63、CK14、CXCR4、BMI-1 和波形蛋白）以及分化的 LESCs 标记物（CK3 和连接蛋白 43）。
下面来看具体的研究结果：
- 细胞产量：经过 12 天的培养，研究人员发现，角膜缘植块在 hAM 上传代培养时，第 0 代、第 1 代和第 2 代扩增的细胞数量分别为 153,333 ± 35,119、360,000 ± 43,589、173,333 ± 51,316。其中，第 1 代的细胞产量显著高于其他代（p <0.05） ，不过第 1 代和第 2 代的细胞产量并无显著差异（p> 0.05）。这表明在传代过程中，第 1 代在细胞数量的增长上具有明显优势。
- 免疫细胞化学分析：CK14 阳性细胞在各代中的数量较为相似；波形蛋白阳性细胞在第 0 代时数量最少，第 1 代时最多；CK3 阳性细胞则在第 0 代时数量最多。这些结果说明不同代次的细胞在某些蛋白表达上存在差异，反映出细胞特性随着传代发生了变化。
- RT-qPCR 分析：CK3 和连接蛋白 43 的表达在第 0 代细胞中明显高于第 2 代细胞；而 CXCR4 和 BMI-1 的表达在第 1 代细胞中显著高于第 0 代细胞。这进一步从基因表达层面揭示了不同代次细胞的差异，为了解细胞在传代过程中的变化提供了更深入的信息。
综合研究结果，研究人员得出结论：角膜缘植块在 hAM 上传代培养会使细胞呈现出不同的特性。传代后细胞中 CK3 表达减少、ABCG2 表达增加，这暗示传代有可能增加体外在 hAM 上培养的角膜缘植块中的干细胞数量。
在讨论部分，研究人员指出，尽管目前利用组织工程技术体外扩增 LESCs 治疗 LSCD 是很有前景的策略，但在优化体外扩增方式和确定 LESCs 分子标记物方面，仍有许多研究工作要做。而本次研究对传代影响的探索，为后续进一步优化治疗方案、更深入了解 LESCs 特性提供了重要依据，有助于推动 LSCD 临床治疗的发展，为众多 LSCD 患者带来新的希望。
