中华绒螯蟹中 pacifastin 型丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫功能及酚氧化酶原系统调控研究

为解决中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）因高密度养殖引发疾病致经济损失，且 pacifastin 在其免疫中作用不明的问题，研究人员开展 pacifastin 免疫功能及对酚氧化酶原（proPO）系统调控研究。结果显示其有抑菌活性，能调节免疫。该研究为病害防控提供理论支持。

　　在水产养殖业蓬勃发展的当下，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）作为我国重要的养殖蟹类，产量逐年攀升。2023 年，中华绒螯蟹产量达到 888,629 吨，其身影遍布我国东南沿海地区，以及长江和黄河流域。随着市场对螃蟹需求的不断增加，养殖户们为了提高产量，采用了高密度养殖和集约化人工繁育的方式。然而，这种做法却带来了一系列问题。高密度养殖使得螃蟹们 “挤” 在了一起，生存空间变得狭窄，这就像是把一群人塞进了一个小房间，不仅活动受限，还容易引发各种健康问题。螃蟹们也不例外，各种细菌和病毒疾病开始频繁爆发，让养殖户们遭受了严重的经济损失。同时，养殖环境也逐渐恶化，就像原本干净整洁的房间变得脏乱差，这对螃蟹的生长和繁殖都产生了极大的负面影响。

在螃蟹的免疫系统中，酚氧化酶原（proPO）系统起着至关重要的作用，它就像是螃蟹体内的 “防御卫士”，参与黑色素化过程，是甲壳动物重要的先天性免疫防御机制。而 pacifastin 作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一员，在调节 proPO 系统方面扮演着重要角色。它既能像 “刹车” 一样平衡 proPO 级联反应，防止免疫过度激活，又能像 “助力器” 一样参与免疫增强过程。但是，目前关于 pacifastin 在中华绒螯蟹中的具体免疫作用，以及它与 proPO 系统之间复杂的调控关系，还存在许多未知。就好比在一个复杂的机器中，虽然知道某个零件很重要，但却不清楚它具体是如何运作的。这就促使科研人员们展开深入研究，试图揭开这些谜团。

南昌大学的研究人员勇挑重担，开展了关于中华绒螯蟹中 pacifastin 型丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫功能及酚氧化酶原系统调控的研究。他们的研究成果对于推动中华绒螯蟹健康养殖、保障水产养殖业可持续发展具有重要意义，该研究成果发表在《Fish》杂志上。

在研究过程中，研究人员采用了多种关键技术方法。首先是原核表达和蛋白质纯化技术，通过这项技术获得了重组 pacifastin - GST 蛋白。接着，利用丝氨酸蛋白酶抑制活性、细菌结合、细菌凝集和细菌清除实验，在体外和体内分析了重组蛋白的抗菌效果。此外，还运用细菌感染和小干扰 RNA（siRNA）干扰实验，探究 pacifastin 与 proPO 系统中主要酶活性和基因表达的关系。最后，借助 GST pull - down 联合质谱分析技术，筛选出与 pacifastin 潜在相互作用的蛋白。

下面我们来详细看看研究结果：

1. 重组蛋白的诱导与纯化

pacifastin 结构域编码的蛋白大小为 30.04 kDa，GST 标签蛋白为 26 kDa，二者结合形成的 pacifastin - GST 重组蛋白大小为 56.04 kDa。在诱导表达实验中发现，在 0.5 mM IPTG、16°C、200 rpm/min 的条件下诱导 10 h，pacifastin - GST 重组蛋白的表达量达到最高；而 GST 标记蛋白在 0.5 mM IPTG、37°C、200 rpm/min 的条件下诱导 5 h 时，表达量最高。这就像是找到了开启蛋白质表达 “开关” 的最佳时机，为后续研究提供了充足的实验材料。

2. pacifastin - GST 蛋白对中华绒螯蟹的体内外抗菌效果

研究人员成功克隆了中华绒螯蟹 pacifastin 基因（1036 bp），该基因编码一个含有 276 个氨基酸的蛋白质，并且包含六个保守的 pacifastin 轻链（PLD）结构域。通过定量实时 PCR 分析发现，在受到鳗弧菌刺激 2 小时和 12 小时后，pacifastin 的表达显著上调。这表明 pacifastin 可能参与了中华绒螯蟹对病原菌的免疫应答反应，就像是螃蟹体内的免疫系统在病原菌入侵时，迅速 “召唤” pacifastin 来帮忙抵御外敌。进一步的体外和体内实验表明，重组 pacifastin - GST 蛋白对丝氨酸蛋白酶具有特异性抑制活性，并且对不同种类的细菌表现出不同的结合亲和力。它能够促进金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的聚集，有助于螃蟹更有效地清除这些病原菌，就像给病原菌 “绑” 在了一起，方便免疫系统识别和消灭。

3. pacifastin 与 proPO 系统的关系

细菌感染实验和 siRNA 干扰实验结果显示，pacifastin 能够通过调节 proPO 激活级联反应中相关基因的表达，来调控宿主对嗜水气单胞菌感染的免疫反应。当 pacifastin 的表达受到干扰时，proPO 系统的关键成分表达也会发生变化，进而影响螃蟹的免疫功能。这说明 pacifastin 在 proPO 系统中就像一个 “指挥官”，精细地调控着免疫反应的进程，确保螃蟹的免疫系统能够准确应对病原菌的入侵。

4. 筛选潜在相互作用蛋白

利用 GST pull - down 联合质谱分析技术，研究人员从嗜水气单胞菌中鉴定出了与 pacifastin 潜在相互作用的蛋白。这些蛋白的发现为深入理解 pacifastin 介导的免疫防御分子机制提供了新的线索，就像找到了打开 pacifastin 免疫防御机制大门的新钥匙。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：重组 pacifastin - GST 蛋白在中华绒螯蟹的免疫防御中发挥着重要作用，它不仅具有抗菌活性，还能通过调节 proPO 系统的相关基因表达来应对病原菌感染。这项研究成果加深了人们对 pacifastin 免疫功能的理解，为中华绒螯蟹及其他甲壳类动物疾病防控策略的开发提供了理论支持。它就像一盏明灯，照亮了水产养殖中病害防治的道路，让养殖户们看到了减少经济损失、保障螃蟹健康生长的希望。未来，研究人员可以基于这些发现，进一步探索 pacifastin 在其他免疫相关过程中的作用，以及开发针对中华绒螯蟹疾病的新型防治方法，为水产养殖业的可持续发展注入新的活力。