探秘非模式纤毛虫钩刺斜管虫基因组重组：解锁大核发育核架构、DNA 含量与染色体碎片化之谜

本文聚焦非模式纤毛虫钩刺斜管虫（Chilodonella uncinata），运用 4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染色、荧光原位杂交（FISH）及共聚焦显微镜技术，研究其核架构与基因组动态，揭示出大核发育阶段的独特性，为纤毛虫基因组进化研究添砖加瓦。

　　

研究背景

纤毛虫是一类多样的单细胞真核微生物，具有独特的基因组结构。其细胞内含有至少一个体细胞大核（macronucleus，MAC）和一个生殖系小核（micronucleus，MIC）。大核高度多倍体，在整个生命周期中基因表达活跃；小核为二倍体，在无性生长阶段保持静止。

在纤毛虫的生活史中，无性繁殖时，小核通过有丝分裂进行分裂，多倍体大核则通过无丝分裂增殖；有性生殖通过接合作用实现，小核经减数分裂产生单倍体产物并在细胞间交换，随后融合形成合子核，合子核再经有丝分裂，一个子核发育为新的大核，另一个成为新的小核 。

尽管在一些模式纤毛虫（如四膜虫Tetrahymena、游仆虫Oxytricha和草履虫Paramecium）中，核结构和基因组动态已得到深入研究，但这些研究结果在多大程度上能代表纤毛虫的多样性仍不清楚。

钩刺斜管虫（Chilodonella uncinata）属于叶咽纲，是一种可培养的非模式纤毛虫，其核架构尚未完全明晰。此前虽有一些关于它的研究，但利用现代荧光技术对其大核发育阶段的研究仍有待完善。本研究旨在通过结合 DAPI 染色和针对端粒序列的 FISH 技术，探究钩刺斜管虫在发育过程中总 DNA 含量的变化和体细胞染色体的成熟情况，进而完善对其核生命周期，尤其是大核发育的理解。

材料与方法

1. 细胞培养与维持：实验所用的钩刺斜管虫（菌株 ATCC PRA - 257）于 2014 年从波兰的样本中分离得到，在 Volvic 天然泉水（瓶装）中培养，并添加高压灭菌的米粒以促进细菌（猎物）生长。培养物置于 6 孔板中，每 3 - 5 天取 200μL 细胞转移至新孔并补充适量 Volvic 水，培养条件为室温、避光，利用明场显微镜（Olympus CKX31）进行细胞培养的日常观察和实验细胞的分离。
2. 实验细胞分离与固定：用 200μL 移液器将 6 孔板中的细胞转移至 Superfrost 载玻片上，在载玻片上用疏水笔绘制方形边界。细胞在载玻片上室温放置 20 分钟后，加入终浓度为 2% 的 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育 20 分钟。随后吸去大部分液体，用 1×PBS 洗涤 3 次。
3. 荧光原位杂交（FISH）：设计针对钩刺斜管虫的寡核苷酸端粒探针，该探针以 Alexa Fluor 488 荧光染料标记于 5’端，基于已确定的直接端粒重复序列（C₄AAA₃）₃设计，可用于估计钩刺斜管虫整个生命周期中基因大小的体细胞（MAC）染色体的相对拷贝数。

固定和洗涤后的细胞，用 0.5% Triton X - 100 在室温下通透 20 分钟，然后用 1×PBS 洗涤 2 次、4× 柠檬酸钠盐溶液（SSC）洗涤 1 次。细胞在预杂交缓冲液（50% 甲酰胺、2×SSC 和无核酸酶水 [NFW]）中室温平衡 30 分钟。杂交缓冲液由 10μM 端粒探针、50% 甲酰胺、4×SSC 溶液和 NFW 混合而成，在 98°C 变性 5 分钟后迅速置于冰上冷却。将 20μL 杂交缓冲液加入细胞，75°C 孵育 5 分钟，然后在 37°C 过夜。次日，载玻片依次在 37°C 的 2×SSC 中洗涤 15 分钟、1×SSC 中洗涤 15 分钟，最后在室温下用 1×SSC 洗涤 15 分钟。用 0.001μg/mL 的 DAPI 对总 DNA 进行复染 2 分钟，之后用 1×PBS 溶液洗涤 1 次，在细胞上滴加 Slow Fade Gold，盖上盖玻片并用指甲油密封。
4. 显微镜观察与成像：使用 Leica TCS SP5 激光扫描共聚焦显微镜对染色细胞进行观察，选用 63× 油浸物镜。用 405nm 的紫外激光激发总 DNA（DAPI），488nm 的氩激光拍摄微分干涉对比（DIC）图像，488nm 波长激发 Alexa Fluor 488 标记的端粒探针。图像采集分辨率为 1,024×1,024，采集速度 200Hz，线平均 16。为生成 8 位深度配置的红、绿、蓝（RGB）彩色图像，对样本进行顺序扫描。实验仅记录形态良好的细胞，排除折叠、挤压或其他可能由制备过程导致的不理想细胞。z 轴堆栈图像采集速度为 700Hz（最初部分以 400Hz 记录），线平均 4，步长 0.13μm，每张 z 轴堆栈图像采集约需 45 - 75 分钟，本研究中所有细胞图像采集总时长约 116 小时，同时通过调整智能增益和智能偏移来优化图像质量。
5. 图像分析：利用 “Nikon NIS Element” 图像分析软件对细胞 / 核体积和总荧光强度进行量化。通过软件中的测量工具手动设置点或轮廓，测量细胞大小（长度 × 宽度，单位为微米）和核直径（围绕细胞核绘制圆圈测量直径，单位为微米），进而计算其半径（单位为微米）和体积（单位为立方微米）。使用软件中的 “ROI（感兴趣区域）” 工具绘制围绕细胞核的多边形或圆形线，通过 “ROI” 统计功能得到平均强度，总强度则通过核体积（立方微米）与每像素平均强度相乘得出。

研究结果

1. 不同生命周期阶段的细胞特征：研究人员对 116 个个体的 250 多个细胞核进行染色观察，涵盖了 23 个营养期细胞、29 个接合期细胞和 64 个发育期（早期和晚期发育）细胞，并推断出钩刺斜管虫的生命周期阶段。研究发现，接合期细胞尺寸较小，平均长度约 31μm，小于营养期（约 40μm）和发育期（约 35μm）细胞。此外，还发现了一些难以归类的细胞，将其归为特殊情况，可能是制备过程中的假象或罕见事件。
2. 营养期细胞：营养期细胞含有一个大型的 “典型” 异质大核（富含 DNA 的物质围绕着一个 DNA 贫乏的中心）和一个位于大核下方的较小生殖系小核。大核可被 DAPI（蓝色，标记总 DNA）和端粒探针（绿色，标记 MAC 染色体）强烈染色，而小核几乎检测不到端粒探针的荧光信号。营养期细胞中总 DNA（DAPI 信号）和端粒信号的比例相对稳定，仅一个细胞的端粒信号高于 DAPI 信号。基于相对荧光单位，总 DNA 含量和染色体数量（通过端粒荧光估计）近乎翻倍，这表明营养期细胞可能处于无性营养生长阶段，包括为大核的无丝分裂做准备，但在这 23 个营养期细胞中未观察到小核的有丝分裂。
3. 接合期细胞：共收集了 29 个接合期细胞的数据，这些细胞表现为成对细胞在口孔处相连。为便于不同生命周期阶段的比较，仅测量每对细胞右侧的个体。在所有分析的接合期细胞中，观察到了减数分裂事件（减数分裂 I 和减数分裂 II）以及细胞核的交换。与营养期细胞相比，接合期细胞中总 DNA（蓝色）和端粒（绿色）的比例变化更大，且尽管接合期细胞体积较小，但总 DNA 含量与营养期细胞相似。
4. 体细胞大核的发育：通过观察含有新、老大核的 64 个发育细胞，将其分为早期发育（老核明显，新核染色较弱）和晚期发育（新核明显）两个阶段，分别有 40 个和 24 个细胞。在发育过程中，总 DNA 与估计的端粒含量的比例发生变化，两者在早期到晚期发育阶段均逐渐增加。对比新发育大核和老核的总 DNA 和基因大小染色体数量发现，老核的 DNA 含量在新核发育过程中并未下降，但端粒信号有所减少，这表明钩刺斜管虫在接合后产生新大核时，可能并非同步回收旧物质。

基于对 100 多个钩刺斜管虫个体约 250 个细胞核的详细观察，研究人员提出了修订后的核生命周期。在接合过程中，小核伸长且数量增加（减数分裂 I），随后出现更多伸长阶段，每个细胞最多有四个小核（减数分裂 II）。推测其中三个单倍体核降解，剩余的单倍体核在与配对细胞交换前进行有丝分裂，然后发生核融合（受精）。合子核进行有丝分裂，一个子核成为新的大核，另一个成为成熟细胞中的新小核。

在钩刺斜管虫的早期发育阶段，老核保持其 “典型” 形态，新发育的大核附着在老核上，且老核通常位于细胞的 “顶部”（靠近细胞前端），新核位于 “底部”（靠近细胞后端，在老核下方）。在晚期发育阶段，老核失去典型形态并逐渐降解，新核逐渐发育成熟，新小核附着或几乎附着在新大核上，之后细胞进入营养期。研究还观察到少数大核大致均分为两部分的情况，推断这可能是无性分裂。
5. 特殊情况：在显微镜观察过程中，发现了一些核阶段异常的细胞。如一个细胞新发育的大核中有染色体，但该大核中几乎没有 DNA；两个个体有三个大核结节，且位置模式不同；还有一个个体的 DNA 分布非常密集。目前尚不清楚这些特殊情况是钩刺斜管虫生命周期中未知的可塑性表现，还是发育的死胡同。

讨论

1. 与其他纤毛虫的异同：本研究利用 FISH 和激光扫描共聚焦显微镜，对非模式纤毛虫钩刺斜管虫的核事件进行了特征分析。研究结果显示，钩刺斜管虫的大核发育模式与之前描述的多种模式纤毛虫以及同属的C. cucullulus和C. steini不同，同时在接合过程中大核 DNA 含量存在意外的变异性，并更新了该物种的生命周期。

钩刺斜管虫的一些核过程与模式纤毛虫有相似之处，如都具有明显区分的生殖系和体细胞大核，且体细胞大核均由接合后的合子核发育而来。然而，它也有独特之处：一是其体细胞大核中的 DNA 组织成明显的富 DNA 区和贫 DNA 区（异质结构）；二是在无丝分裂过程中，异质体细胞大核的内容物翻倍；三是总 DNA 与基因大小染色体丰度的比例相对稳定，而在其他具有广泛碎片化基因组（即含有基因大小染色体）的纤毛虫中，尚未有通过显微镜对该比例进行报道的研究。
2. 接合期和发育阶段的差异：与营养期相对稳定的情况不同，钩刺斜管虫在接合期总 DNA 与基因大小染色体的比例变异性更大，尤其是在生殖系小核进行减数分裂时。目前尚不清楚这种变异性产生的原因，可能与细胞状态和可用资源有关，这需要对更多种类的纤毛虫进行研究，特别是那些具有非典型核架构的纤毛虫（如钩刺斜管虫）。

在其他纤毛虫（如Stylonychia）的发育过程中，可能会从超多倍体的亲代或老的体细胞核中 “回收” 核苷酸，以抵消新体细胞核发育过程中 DNA 扩增的能量消耗。但在钩刺斜管虫中未观察到明显的此类回收证据，新发育大核的 DNA 含量在亲代大核明显降解之前就已增加，亲代（老）大核中核苷酸的最终去向仍不明确，它们可能被分解或用于后续的生命阶段（如第一次或后续的无性分裂）。
3. 与其他具有基因大小染色体纤毛虫的差异：钩刺斜管虫的大核发育与其他具有基因大小染色体的纤毛虫（如旋毛类纤毛虫Stylonychia、Oxytricha和Euplotes ）有显著差异。旋毛类纤毛虫的大核发育经历三个明显阶段：整个基因组的初始扩增阶段、DNA 贫乏阶段（大量 DNA 消除的结果）以及成熟基因大小染色体的最终扩增阶段。而在钩刺斜管虫中未观察到明显的 DNA 消除阶段，在新大核发育过程中，总 DNA 量和基因大小染色体的丰度是协同增加的，这与之前对该物种大核发育的研究结果一致，表明钩刺斜管虫的 DNA 消除可能在整个发育过程中持续进行，类似于草履虫的体细胞发育过程。值得注意的是，钩刺斜管虫估计会消除至少约 30 - 35% 的生殖系 DNA，而Stylonychia则消除超过 90% 的生殖系基因组，这可能是后者进行核苷酸回收的一个驱动因素。
4. 研究意义与展望：本研究通过荧光显微镜技术，更新了钩刺斜管虫的生命周期，展示了接合前减数分裂产物以及发育过程中新大核和小核位置的变化。研究发现小核在发育过程中的位置从细胞后部重新定位到位于老核和发育中的体细胞核之间。大多数关于其他纤毛虫核发育的研究表明，发育中的大核通常位于细胞后部，钩刺斜管虫也有类似现象。这些研究结果进一步拓展了对纤毛虫生命周期的认识，为深入理解纤毛虫的基因组进化和核发育机制提供了重要依据，也为后续研究纤毛虫的多样性和独特生物学特性奠定了基础。未来可进一步探究钩刺斜管虫在不同环境条件下的核发育变化，以及其独特的基因组重组机制与生态适应性之间的关系。