EB1 与 CENP-R 的多价相互作用：调控有丝分裂中染色体振荡的关键机制

本文聚焦有丝分裂中染色体振荡机制，发现微管正端追踪蛋白 EB1 通过液 - 液相分离（LLPS）与 CENP-R 相互作用并形成共凝聚物，这种多价相互作用对染色体振荡至关重要，为理解细胞分裂分子机制提供新视角。

　　

研究背景

在真核细胞中，正确的染色体分离依赖于着丝粒与动粒微管之间的动态相互作用。有丝分裂时，染色体在双定向建立后会在纺锤体两极之间振荡，这对染色体排列和随后的同步分离至关重要，但振荡运动的分子机制尚不清楚。端结合蛋白 1（EB1）是进化上保守的微管正端追踪蛋白，可调节微管正端动力学。近期研究表明，EB1 在体内外可形成生物分子凝聚物，对微管正端追踪起重要作用。而 CENP - R 是组成型着丝粒相关网络（CCAN）的组成部分，在连接着丝粒与纺锤体微管中发挥作用。本研究旨在探究 EB1 与 CENP - R 在有丝分裂染色体振荡中的作用机制。

研究结果

1. EB1 相分离调控有丝分裂染色体振荡：EB1 具有类似液体的性质，在微管正端形成动态的彗星状液滴。表达相分离缺陷型 EB1^KR6Q突变体的有丝分裂细胞常出现有丝分裂进程停滞和染色体排列缺陷，这是动粒 - 微管动力学和动粒沿纺锤体轴振荡运动受干扰的典型表型。通过追踪活细胞中姐妹动粒的振荡运动并绘制其轨迹，发现 EB1 敲低细胞的振荡运动明显受损，重新表达野生型 EB1（EB1^WT）可挽救这一现象，而 EB1^KR6Q则不能，表明 EB1 相分离对染色体振荡起关键调控作用。进一步测量振荡运动的参数，包括偏离平均位置的偏差、姐妹动粒距离、动粒运动速度和姐妹动粒距离的偏差等，结果显示 EB1^WT能恢复这些参数，而 EB1^KR6Q无法恢复，再次证明了上述结论。
2. EB1 和 CENP - R 在体外形成共凝聚物：为鉴定与 EB1 相分离相关且在染色体着丝粒发挥功能的相互作用蛋白，研究人员利用重组的 6×His - EGFP 标记的 EB1 凝胶状凝聚物从 HeLa 细胞裂解物中吸收潜在相互作用蛋白，经质谱分析发现 CENP - R 是从提取物中富集到的主要着丝粒蛋白。在体外实验中，纯化的重组 CENP - OPQU 和 CENP - OPQUR 复合物在 150 mM KCl 盐浓度下可形成纤维状凝聚物网络，且 CENP - OPQUR^AF488形成凝聚物网络的能力更强。将荧光标记的 CENP - OPQU^AF488和 CENP - OPQUR^AF488与重组 mCherry 标记的 EB1^WT进行共凝聚实验，发现 EB1^WT能促进共凝聚，使纤维状凝聚物转变为典型的 LLPS 液滴。此外，CENP - R 能在较低浓度下促进 EB1 的共凝聚，且这种共相分离活性在较高盐浓度下仍能维持，而相分离缺陷型 EB1^KR6Q突变体则不能与 CENP - R 形成共凝聚物。
3. EB1 - CENP - R 相互作用的生化分析：分析 CENP - R 的蛋白质序列，发现其上存在一个 SxIP 样基序，但通过体外的下拉实验和共凝聚实验表明，该基序突变（CENP - R^Mut）不影响 EB1 与 CENP - R 的相互作用。通过核磁共振（NMR）化学位移扰动实验，发现 EB1 的 EBH 结构域与 CENP - R^{1 - 79}的 K22、I23、T24、I30、T31、Y32、S33、T35、L43、F44、A45 和 S46 等多个氨基酸残基存在多个结合界面。将 CENP - R 的 IDR 结构域中上述 12 个氨基酸突变为甘氨酸（CENP - R^12G）后，EB1^WT与 CENP - R^12G的相互作用消失，且 CENP - R^12G突变体失去了与 EB1^WT形成共液滴的能力。在细胞中，利用光激活的 Opto - Droplet 策略，发现野生型 CENP - R 在蓝光照射下可形成凝聚物，且能发生动态融合，而 CENP - R^12G突变体则不能形成凝聚物，表明 CENP - R 本身具有 LLPS 倾向，且上述 12 个氨基酸对其与 EB1 的相互作用至关重要。
4. CENP - R 与 EB1 的相互作用对正常有丝分裂至关重要：为验证 CENP - R 与相分离的 EB1 结合在有丝分裂中的重要性，设计了基于荧光共振能量转移（FRET）的传感器。在 HEK293T 细胞裂解物中，EB1 与 CENP - R^WT的 FRET 信号在约 590 nm 处达到峰值，而 CENP - R^12G的 FRET 信号显著降低，免疫沉淀实验进一步证实了这 12 个氨基酸在细胞中对 EB1 与 CENP - R 相互作用的重要性。将 CENP - R^WT或 CENP - R^12G突变体导入内源性 CENP - R 被 shRNA 耗尽的 HeLa 细胞中，发现 CENP - R^12G突变体导致染色体错排和有丝分裂进程停滞，表明 EB1 与 CENP - R 的相互作用对准确的染色体排列和分离至关重要。
5. CENP - R 与 EB1 相互作用调节染色体振荡：研究表明，CCAN 是动粒 - 微管动力学的直接调节因子，将着丝粒 DNA 与微管正端物理连接。在 HeLa 细胞中表达 CENP - R^WT或 CENP - R^12G突变体并监测染色体振荡运动，发现 CENP - R 耗尽的细胞中动粒振荡明显受损，重新表达 CENP - R^WT可挽救这一缺陷，而 CENP - R^12G突变体则不能。此外，CENP - R^12G突变体缩短了姐妹动粒间的距离，表明 EB1 与 CENP - R 的相互作用对姐妹动粒间张力的形成至关重要，进而说明 EB1 与 CENP - R 的多价相互作用在调节染色体振荡中起关键作用。

研究讨论

有丝分裂染色体的正确分离依赖于持续的动粒 - 微管附着，而 EB1 介导的相分离在调节微管正端组装和染色体运动中起重要作用。本研究揭示了 EB1 与 CENP - R 协同作用确保有丝分裂中动粒 - 微管动力学正常调节染色体运动的机制。EB1 和 CENP - R 的多价相互作用在进化上具有重要意义，可能是后生动物为确保多细胞系统中染色体忠实分离而演化出的特殊机制。研究还发现，EB1 与 CENP - R 的相互作用促进了体外微管束的形成，推测其在体内可能作为分子胶，将着丝粒附近的多个动粒附着微管束在一起，并使 CENP - R 驻留的动粒与 EB1 追踪的微管正端紧密相连。未来，需要通过先进的光学成像技术对 EB1 - CENP - R 共凝聚物进行高分辨率结构分析，以进一步明确 CENP - R 对 EB1 共凝聚的精确贡献。此外，鉴于 EB1 与腺瘤性息肉病 coli（APC）蛋白相互作用的异常与家族性结直肠癌的发病机制相关，本研究揭示的 EB1 与 CENP - R 相互作用的物理化学代码可能为细胞更新质量控制提供新的调控机制。

研究局限

本研究聚焦于染色体振荡的分子特征，虽证实了 EB1 与 CENP - R 相互作用对染色体振荡和有丝分裂的重要性，但仍存在一些局限性。由于整个有丝分裂纺锤体上 EB1 信号的背景噪声，无法通过 FRET 在细胞中可视化这种相互作用。在染色体振荡过程中，与领先和落后动粒相连的纺锤体微管分别同时进行聚合和 depolymerization，但目前尚不清楚这种同步性和染色体运动方向的改变是如何实现的，可能有一些运动蛋白参与其中。此外，NDC80 复合物在连接染色体动粒与纺锤体微管正端中起关键作用，但在纺锤体微管生长的动粒上，其功能仍不明确。