云杉几丁质酶基因（PaChi）的分子鉴定与功能解析：开启植物抗真菌防御新视角

该研究从云杉（Picea asperata）中分离出几丁质酶基因 PaChi，发现其在根部高表达，受病原菌（Lophodermium piceae）诱导，重组蛋白有几丁质酶活性且影响病原菌菌丝形态，为研究植物抗真菌机制提供重要依据。

　　

引言

几丁质（chitin）是自然界中含量丰富的多糖，广泛存在于真菌细胞壁，但植物体内没有。几丁质酶（chitinase，EC 3.2.1.14）属于糖基水解酶（glycosyl hydrolases，GH）家族，能够水解几丁质中的 β - 1,4 - 糖苷键，释放几丁寡糖。在植物与病原菌相互作用过程中，几丁寡糖可激活植物的免疫反应，因此几丁质酶作为病程相关（pathogenesis - related，PR）蛋白，在植物防御系统中发挥重要作用。

根据催化结构域的序列相似性，几丁质酶可分为 GH18 和 GH19 两个主要家族，植物几丁质酶的这两个家族又进一步细分为 5 个不同类别（I - V 类）。此前，已有研究在多种植物中克隆和研究了几丁质酶基因，发现它们不仅参与植物对病原菌的防御，还在抵御植食性昆虫和应对非生物胁迫等方面发挥作用。

在松科植物中，也有关于几丁质酶的报道，但云杉（Picea asperata）几丁质酶的研究尚未见报道。云杉是中国西南亚高山森林的优势树种，近年来受病原菌 Lophodermium piceae 感染引发的落针病影响，大面积人工林生长受阻甚至死亡。研究人员通过对云杉响应 L. piceae 感染的转录组测序发现，一类 IV 几丁质酶基因显著上调，因此开展了后续研究，旨在填补云杉几丁质酶研究的空白，为云杉抵御病原菌感染的机制提供理论依据。

材料与方法

1. 植物材料：选取中国泸定县林场自然生长的 22 年生云杉，采集其根、韧皮部、小枝、针叶、幼果和种子等组织样本，同时采集感染 L. piceae 0、1、3 和 5 个月的针叶样本，以同期健康针叶为对照，每个样本设置 3 个独立生物学重复，样本采集后立即液氮速冻， - 80℃保存用于后续 RNA 提取。
2. 总 RNA 提取和逆转录：取 100 mg 云杉组织，液氮研磨后用 Quick RNA Isolation Kit 提取总 RNA，用 Nanodrop 2000 分光光度计测定 RNA 浓度。取 2 μg RNA，按照 PrimeScriptTM RT Reagent Kit 说明书进行 cDNA 合成，健康针叶的 cDNA 用于基因克隆，所有组织的 cDNA 用于表达分析。
3. PaChi 基因全长克隆：依据云杉转录组文库（未发表）和挪威云杉同源几丁质酶基因（GenBank ID：AY544780.1）的核苷酸序列，使用 Premier 软件设计一对特异性引物 PaChi - F1 和 PaChi - R1。以 cDNA 为模板，用 2×Trans Taq^? High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix 进行 PCR 扩增。扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，连接到 pMD19 - T 载体，转化至 DH5α 感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR 和测序鉴定阳性克隆，将 PaChi 基因核苷酸序列提交至 NCBI Genbank（登录号：OR960554）。
4. 生物信息学分析：利用 ORF finder 工具分析开放阅读框（open reading frame，ORF），DNAMAN 软件推导氨基酸序列，ESPript 3.0 进行多序列比对，ProtParam 工具分析蛋白质理化性质，SignalP 5.0 预测信号肽，InterPro 和 Conserved Domain Database 分别分析蛋白质功能位点和保守结构域，SOPMA 和 SWISS - MODEL 分别预测蛋白质二级和三级结构，MEGA 6.0 使用邻接法（neighbor - joining，NJ）构建系统发育树。
5. 实时定量 PCR：根据 PaChi 编码序列设计引物 PaChi - F2/PaChi - R2，以 EF（Elongation factor - 1 alpha）和 TIF5A（translation initiation factor 5A）为内参基因。用 TB Green^? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）kit 进行 RT - qPCR，反应条件为 95℃预变性 30 s，95℃变性 5 s、60℃退火延伸 30 s，共 40 个循环，最后进行熔解曲线分析（65 - 95℃）。每个实验设置 3 个生物学重复和 3 个技术重复，采用 2^???Ct法计算基因相对表达量，用 IBM SPSS 20.0 分析基因表达差异的显著性。
6. 蛋白质表达和纯化：以 pMD19T - PaChi 质粒为模板，用含 EcoR I 和 Hind III 酶切位点的引物 PaChi - F3/PaChi - R3 扩增 PaChi 编码序列，纯化后连接到 pET - 28a 原核表达载体，测序鉴定正确后转化至 E. coli BL21（DE3）细胞。在含 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37℃、180 rpm 振荡培养至 OD₆₀₀ = 0.8，优化 IPTG 浓度和诱导时间进行诱导表达。收集细胞，经冻融裂解后，用 Protein Purification Kit 纯化可溶性重组蛋白，12% SDS - PAGE 分析重组蛋白表达和纯化情况。
7. 重组 PaChi 酶活性测定：以胶体几丁质为底物，按照文献方法测定几丁质酶活性。反应体系包括 1% 胶体几丁质和 0.2 mL（0.09 mg/mL）酶溶液，50℃孵育 30 min 后，加入 2.0 mL DNS 溶液，煮沸 10 min 终止反应，冷却至室温后测定 540 nm 处吸光度，计算释放的还原糖量，1 个酶活性单位定义为每分钟产生 1 μmol N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺所需的酶量。分别在不同 pH（3 - 9）和温度（30 - 80℃）条件下测定酶活性，每个测试设置 3 个重复。
8. 重组 PaChi 抗真菌活性测定：将 100 μL（0.09 mg/mL）重组 PaChi 均匀涂布在固化的 PDA 培养基上，接种直径 5 mm 的 L. piceae 菌碟，25℃培养 15 天，以不含重组 PaChi 的 PDA 培养基为对照。取少量菌丝于 100 μL 重组 PaChi 溶液（0.09 mg/mL）中，25℃处理 48 h，以无菌水为对照，用光学显微镜观察菌丝形态，实验设置 3 个重复。

结果

1. PaChi 序列分析：通过 PCR 扩增获得 768 bp 的 PaChi 基因 PCR 产物，其全长 cDNA 序列包含 768 bp 的编码序列，编码 255 个氨基酸残基。推导的 PaChi 蛋白分子量为 26.123 kDa，理论等电点为 7.85。保守结构域搜索表明，PaChi 属于糖苷水解酶家族 19 蛋白，含有几丁质酶结构域，N 端有信号肽和几丁质结合结构域（chitin - binding domain，CBD）。
   同源性分析显示，PaChi 与其他植物几丁质酶高度相似，与西加云杉（Picea sitchensis）CHI 序列一致性高达 95.69%。多序列分析表明，PaChi 的 CBD 结构域和几丁质酶结构域高度保守，信号肽区域存在差异。ScanProsite 分析发现，PaChi 的 GH19 催化结构域包含两个特征序列。
2. 结构分析：利用 SOPMA 工具预测 PaChi 的二级结构，结果显示其由 46.43% 的螺旋（α - 螺旋和 η - 螺旋）、31.04% 的无规卷曲、16.21% 的 β - 折叠和 6.32% 的 β - 转角组成，含有 12 个半胱氨酸残基，形成 6 个二硫键。通过 PDB 数据库搜索，发现挪威云杉 PaChi（PDB ID Q6WSR8）与目标蛋白三维结构相似度最高，可作为同源建模模板。结构叠加显示，二者 CBD 结构域和催化结构域高度相似，PaChi 催化结构域有 19 个潜在糖结合位点，其中 2 个与 PaChi - Q6WSR8 不同。PaChi - Q6WSR8 的 3 个催化活性位点中，GLU - 138 和 GLU - 147 在 PaChi 中高度保守，暗示 PaChi 可能具有类似的酶功能。
3. PaChi 的系统发育分析：使用邻接法结合 Clustalx1.81 和 MEGA6.05 工具，构建 PaChi 与其他植物几丁质酶的系统发育树。结果显示，植物几丁质酶进化为 5 个主要类群，PaChi 与松科植物 IV 类几丁质酶聚类，与挪威云杉 IV 类几丁质酶 Chia4 - Pa1 亲缘关系密切。
4. PaChi 的表达特性：通过实时定量 PCR 分析 PaChi 在不同组织中的表达情况，发现其在所有检测组织中均有表达，在根中表达量最高，其次是幼果，韧皮部表达量最低。由于 L. piceae 主要感染云杉针叶，研究重点分析了感染 L. piceae 后针叶中 PaChi 的转录水平变化。结果显示，L. piceae 感染可诱导 PaChi 表达，感染 1 - 5 个月时表达量显著增加，1 个月时达到峰值，为对照的 3.59 倍，之后逐渐下降，但仍显著高于对照。
5. 重组 PaChi 的表达、酶学性质和抗真菌活性：IPTG 诱导 E. coli BL21（DE3）表达重组蛋白，SDS - PAGE 分析显示，诱导后出现约 27 kDa 的蛋白条带，与预期的重组 PaChi 分子量一致。不同浓度 IPTG 诱导对重组 PaChi 表达水平无显著影响，诱导 2 h 时重组蛋白产量较高，延长诱导时间表达量无明显增加。纯化后的可溶性重组 PaChi 浓度为 0.09 mg/mL。
   酶学性质分析表明，纯化的重组 PaChi 具有几丁质酶活性，酶活性为 4.61 U/mg。在 pH 3 - 9 范围内，最适 pH 为 7，此时酶比活性最高，为 5.69 U/mg；在 30 - 80℃范围内，最适温度为 40℃，酶比活性为 5.73 U/mg。
   抗真菌活性实验显示，重组 PaChi 对 L. piceae 菌丝生长无显著抑制作用，但显微镜观察发现，处理后的 L. piceae 菌丝出现细胞肿胀等异常形态变化，而对照组未出现这些变化。

讨论

几丁质酶作为植物中的广谱抗性蛋白，在植物与含几丁质生物的相互作用中发挥重要作用。本研究首次从云杉中克隆并鉴定了 GH19 家族的新成员 PaChi，其具有保守的几丁质酶催化结构域和 CBD 结构域，属于 IV 类 PR3 蛋白。基因表达分析表明，PaChi 的表达受 L. piceae 感染上调，抗真菌活性分析显示其对 L. piceae 菌丝形态和包涵体有不利影响，表明 PaChi 可能参与云杉对生物胁迫的防御反应。

研究发现，几丁质酶基因在植物各组织中均有表达，并非完全由胁迫诱导。本研究中，PaChi 基因在云杉根、韧皮部、针叶、幼果和种子中均有表达，且在根中表达量最高，暗示其可能参与云杉根的生长发育；在针叶中表达量也较高，可能与针叶的生长发育及防御反应有关；而在韧皮部表达量较低，表明其在韧皮部形成中作用较小。

已有研究表明，植物 - 病原菌相互作用后几丁质酶活性显著增加，几丁质酶基因表达可提高植物对病原菌入侵的抗性。本研究中，L. piceae 感染云杉针叶后，PaChi 基因表达在早期显著上调，表明其可能在云杉抵御 L. piceae 感染的早期防御中发挥作用。

通过将目标基因转入原核细胞表达和纯化，可在体外研究蛋白质功能。本研究利用 pET28a 载体和 E. coli BL21（DE3）细胞表达不含信号肽的成熟肽编码序列，成功获得分子量约 27 kDa 的重组 PaChi 蛋白。虽然在 37℃、低 IPTG 浓度下短时间诱导可产生大量目标蛋白，但只有少量为可溶性蛋白。后续可进一步优化实验条件，如降低温度提高重组蛋白溶解度等。重组 PaChi 具有几丁质酶活性，其酶活性与其他物种几丁质酶存在差异，可能与酶的结构特征或底物亲和力有关。其最适 pH 为 7，最适温度为 40℃，与部分已报道的几丁质酶不同。

几丁质酶通过分解病原菌细胞壁中的几丁质发挥抗真菌作用。本研究中，纯化的 PaChi 对 L. piceae 菌丝生长无显著抑制作用，可能是由于 PaChi 浓度或酶活性不足，也可能与不同真菌细胞壁的化学组成和结构差异有关。但重组 PaChi 可改变 L. piceae 菌丝形态，导致包涵体聚集和细胞肿胀，反映了其在云杉抗落针病中的作用。本研究在 25℃进行抗真菌活性测试，而重组 PaChi 的最适酶活温度为 40℃，这可能是其对菌丝生长抑制效果不明显的原因，后续可在最适酶活温度下进一步测试其抗真菌活性。此外，植物几丁质酶是一个多基因家族，各基因可能发挥不同功能，未来可利用宏基因组学从云杉中发现新的几丁质酶，筛选更好的抗性基因。

结论

本研究成功从云杉中提取并鉴定了几丁质酶基因 PaChi，其包含 IV 类几丁质酶典型的 CBD 结构域、催化结构域和关键活性位点。PaChi 在云杉根中高表达，可能参与根的生长发育。L. piceae 感染后，PaChi 转录水平显著上调，尤其是感染早期，表明其参与了云杉的防御反应。重组 PaChi 蛋白具有几丁质酶活性，对 L. piceae 菌丝形态有不利影响，显示出其在对抗病原菌方面的重要潜力，为进一步研究云杉对 L. piceae 入侵的抗性机制提供了参考。