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犬新孢子虫（Neospora caninum）可致孕牛流产和犬运动神经紊乱，危害严重。PKG 在顶复门寄生虫信号转导中关键，但在犬新孢子虫中未被深入研究。研究人员敲低犬新孢子虫 PKG，发现其影响虫体入侵、逸出等，还鉴定出相关下游靶点。该研究为理解犬新孢子虫致病机制提供新视角。
在动物健康领域，犬新孢子虫（
Neospora caninum）可是个 “狠角色”。它属于顶复门的专性细胞内寄生虫，能让怀孕的母牛流产，还会导致狗狗患上运动神经紊乱疾病，给畜牧业带来了巨大的经济损失。一直以来，科学家们都在努力探寻它的致病机制，试图找到有效的防控方法，但进展并不顺利。
在寄生虫的生命活动里，蛋白激酶起着至关重要的作用，它们参与调节寄生虫的各种生理功能。其中，环磷酸鸟苷（cGMP）依赖性蛋白激酶（PKG）在顶复门寄生虫的信号转导中占据核心地位，就像交通枢纽一样，掌控着各种信号的传递。然而，PKG 在犬新孢子虫中的具体特征还不清楚，它的下游靶点以及调控的信号通路也如同迷雾一般。为了拨开这些迷雾，中国农业大学的研究人员开展了一项意义重大的研究，相关成果发表在《Communications Biology》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9 技术和 mini auxin-inducible degron 系统（mAID）），这就像是一把精准的 “分子剪刀”，可以对犬新孢子虫的基因进行编辑和调控；还有定量磷酸化蛋白质组学技术，它能帮助研究人员全面地分析蛋白质的磷酸化情况，找到受 PKG 调控的下游蛋白。
研究结果如下：
- N. caninum PKG 对速殖子体外生长至关重要：研究人员在犬新孢子虫中发现了一个 PKG 基因，编码 997 个氨基酸的蛋白质。他们尝试用 CRISPR/Cas9 技术敲除这个基因，但没有成功，这暗示了 PKG 对犬新孢子虫的生存非常重要。于是，研究人员采用 mAID 策略，成功地在 NcTIR1 菌株中实现了对 PKG 的条件性敲低。通过一系列实验，他们发现敲低 PKG 后，犬新孢子虫在体外形成的菌斑显著减少，这充分说明了 PKG 在犬新孢子虫的体外生长过程中发挥着不可或缺的作用。
- NcPKG 参与入侵、逸出和运动过程：研究人员进一步探究 PKG 的功能，发现它虽然对寄生虫的细胞内增殖没有显著影响，但在入侵、逸出和运动方面却有着重要作用。敲低 PKG 后，寄生虫的入侵能力明显下降，在钙离子载体 A23187 诱导下，逸出比例大幅降低，自然逸出也受到严重抑制。同时，PKG 还能调节寄生虫的滑行运动，敲低 PKG 会使寄生虫的滑行运动效率降低。
- 激活 NcPKG 可促进微线体分泌并增强胞质钙波动：微线体分泌对于寄生虫的运动和入侵至关重要。研究人员发现，激活 PKG 能够促进微线体分泌，敲低 PKG 则会导致微线体分泌的 NcMIC11 和 NcMIC6 水平显著下降。此外，研究人员利用基因编码的钙传感器（GCaMP6f）构建了 Nc1/GCaMP6f 菌株，发现激活 PKG 可以增强胞质钙波动，而敲低 PKG 后，这种钙波动的增强作用就消失了，这表明 PKG 在调节胞质钙水平方面起着关键作用。
- 定量磷酸化蛋白质组学分析揭示 NcPKG 影响多种信号通路：为了深入了解 PKG 的作用机制，研究人员用 PKG 抑制剂 MBP146 - 78 处理犬新孢子虫速殖子，然后进行定量磷酸化蛋白质组学分析。他们总共鉴定出 1125 个可能受 PKG 调控的下游蛋白，这些蛋白参与了信号转导、转录调控、脂质运输和代谢等多个重要过程，这表明 PKG 在犬新孢子虫的众多核心过程中都扮演着重要角色。
- NCLIV_005460（CACNAP）与钙通道蛋白相关，影响钙内流：在受 PKG 调控的蛋白中，研究人员发现 NCLIV_005460 编码的蛋白具有离子运输结构域，与阳离子通道家族转运体相似。进一步研究发现，它定位在寄生虫的质膜上，敲除该基因会导致寄生虫对细胞外钙刺激的反应减弱，这表明它参与了细胞外钙的内流过程，因此被命名为 N. caninum Ca2+通道相关蛋白（NcCACNAP）。
- Δcacnap 寄生虫在逸出效率和运动能力方面存在缺陷：研究人员对敲除 CACNAP 的 Δcacnap 寄生虫进行研究，发现其菌斑形成面积显著减小，毒力降低。在逸出和运动方面，Δcacnap 寄生虫的自然逸出能力明显下降，在各种刺激下的逸出率都低于野生型菌株，运动能力也受到损害。此外，研究人员还发现，过表达 CACNAP 会对寄生虫的生长产生负面影响。
综合研究结果和讨论部分，这项研究首次全面地揭示了犬新孢子虫中 PKG 的功能及其下游调控机制。PKG 在调节犬新孢子虫的入侵、逸出、运动、微线体分泌和钙动员等过程中都起着关键作用，而 CACNAP 则参与了质膜上的钙内流过程，影响着寄生虫的逸出和运动。这些发现为我们深入理解犬新孢子虫的致病机制提供了重要线索，也为开发针对犬新孢子虫病的新型治疗方法和防控策略奠定了坚实的理论基础，有望在未来帮助畜牧业减少犬新孢子虫带来的经济损失，保障动物健康。
