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蜘蛛牵引丝蛋白（MaSp）因高机械性能和生物相容性具广泛应用潜力，但存在异源表达难、下游处理成本高及有机溶剂毒性等问题。本研究通过引入 SUMO 融合标签和自剪切肽内含子（intein），在大肠杆菌中实现可溶性表达 rMaSp1s 及其二聚体，经发酵优化后产量显著提升，为规模化生产奠定基础。
蜘蛛丝以其超越钢铁的抗拉强度和出色延展性，一直被视为自然界的 “生物材料奇迹”。蜘蛛牵引丝主要由大壶状腺分泌的 MaSp1 和 MaSp2 构成，其核心区域富含丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly）重复序列，形成 β- 折叠结晶区和柔性无定形区，赋予丝纤维优异力学性能。然而，蜘蛛的孤居习性和极低产丝量（一只蜘蛛年产丝仅约 100 毫克），使其难以通过传统养殖实现规模化生产。
长期以来，利用重组生物技术生产蜘蛛丝蛋白（spidroin）是科学界的重要目标，但面临多重挑战：天然 MaSp 分子量高达 200-350 kDa，基因中 GC 含量高达 70%，导致在大肠杆菌等宿主中易形成包涵体，且翻译提前终止；传统生产需依赖六氟异丙醇等有机溶剂溶解蛋白，不仅成本高昂，还存在毒性风险。因此，开发可溶性表达策略及高效发酵工艺，成为突破蜘蛛丝蛋白产业化瓶颈的关键。
为解决上述问题，南京工业大学的研究团队聚焦于一种来源于摩鹿加云斑蛛（Cyrtophora moluccensis）的短链 MaSp1（MaSp1s）。该蛋白分子量仅 40 kDa，核心区域缺乏典型重复序列和长聚丙氨酸（poly (A)）基序，理论上更易实现异源可溶性表达。研究团队在《Microbial Cell Factories》发表论文，系统报道了利用大肠杆菌规模化生产 rMaSp1s 及其二聚体的关键技术突破。
研究采用的主要技术方法包括：
- 融合表达系统构建：将 SUMO 融合标签与自剪切肽内含子（intein）串联至 MaSp1s 基因上下游，构建 pET21a (+)-SUMO-Intein-rMaSp1s 表达载体，利用 SUMO 标签增强可溶性，通过 intein 实现翻译后自剪切去除标签。
- 发酵工艺优化：通过摇瓶发酵响应面分析（RSA）优化诱导条件（IPTG 浓度、温度、时间），并在 5 L 发酵罐中进一步优化接种量、诱导温度、装液量及补料策略，同时添加金属离子（如 Mg2?、Ca2?）和生长因子（酵母提取物等）提升菌体密度和蛋白表达。
- 二聚体构建技术：通过两种策略制备 rMaSp1s 二聚体：一是在体内直接表达双核心区域序列（rMaSp1s-2Core）；二是在体外通过 C 端引入半胱氨酸（Cys）残基，利用氧化还原条件（GSSG/GSH）诱导二硫键形成。
研究结果
1. 可溶性表达系统的有效性
在摇瓶发酵中，引入 SUMO-Intein 标签的 rMaSp1s 和 rMaSp1s-2Core 可溶性表达量分别达 218.9 mg/L 和 95.76 mg/L，显著高于传统无标签表达（主要以包涵体形式存在）。SDS-PAGE 显示，优化后可溶性蛋白占总蛋白比例超 15%，且通过 Ni2?-NTA 亲和层析纯化后纯度达 95% 以上。
2. 发酵放大与工艺优化
在 5 L 发酵罐中，通过补料分批发酵策略（蔗糖和蛋白胨补料），结合 pH 值（6.8）和溶氧（25-40%）精确控制，rMaSp1s 产量提升至 1,112.2 mg/L（较摇瓶提高 5.08 倍），rMaSp1s-2Core 达 297.8 mg/L（提高 3.11 倍），创大肠杆菌中可溶性蜘蛛丝蛋白产量新纪录。
3. 二聚体构建与结构分析
体外二聚化实验表明，在 7 mM 氧化型谷胱甘肽（GSSG）条件下，rMaSp1s 单体通过 C 端二硫键形成稳定二聚体，非还原 SDS-PAGE 显示二聚体占比超 80%。圆二色谱（CD）和傅里叶红外光谱（FTIR）分析显示，二聚体的 β- 折叠含量（35%）显著高于单体（22%），原子力显微镜（AFM）观察到二聚体自组装形成直径约 225 nm 的网状纳米纤维，而单体仅形成不规则颗粒，表明二聚化显著增强蛋白自组装能力。
4. 生物相容性与应用潜力
研究未直接涉及生物相容性实验，但通过避免使用有机溶剂溶解蛋白，从源头降低了传统工艺的毒性风险。结合 MaSp1s 天然的低免疫原性和可降解性，其规模化生产为生物医学领域（如手术缝线、组织工程支架）及高性能材料（防弹纤维、环保塑料）应用奠定了基础。
研究结论与意义
本研究通过融合标签设计和发酵工艺创新，首次实现 MaSp1s 及其二聚体在大肠杆菌中的高效可溶性表达，突破了传统蜘蛛丝蛋白生产的溶解度和产量瓶颈。关键技术包括：
- SUMO-Intein 系统：解决了高分子量蛋白易形成包涵体的难题，实现翻译后标签自动去除，简化下游纯化流程。
- 发酵放大策略：通过金属离子优化和补料控制，显著提升菌体密度（OD???达 5-6）和蛋白产率，为工业化生产提供了可复制的工艺参数。
- 二聚体构建方法：体内外双策略为蜘蛛丝蛋白分子工程提供了新工具，二聚体的高 β- 折叠含量和自组装能力，为开发高强度人工丝纤维指明了方向。
该研究不仅推动了蜘蛛丝蛋白从实验室到工业化的跨越，还为其他难表达的重复序列蛋白（如弹性蛋白、胶原蛋白）提供了通用解决方案。未来通过进一步优化重复单元数目和引入仿生纺丝技术，有望开发出媲美天然蜘蛛丝的高性能生物材料，在医疗、国防、环保等领域引发革命性应用。
