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本文聚焦鳜鱼蛙病毒（MRV）感染机制，发现 MRV 感染首先靶向幽门盲囊浆膜层，引发纤维蛋白性浆膜炎。借助单细胞 RNA 测序，剖析细胞组成，明确免疫与基质细胞作用，揭示病毒驱动浆膜炎是腹水根源，为鱼类病毒病研究提供新视角。
研究背景与目的
虹彩病毒科（Iridoviridae）中的蛙病毒属（Ranavirus）可感染多种冷血脊椎动物，导致高发病率和死亡率。鳜鱼蛙病毒（MRV）作为该属新成员，与大口黑鲈病毒（LMBV）全基因组核苷酸同源性超 98%，但其感染鳜鱼时会引发独特的严重腹水症状，而其他蛙病毒感染未见此表现。本研究旨在探究 MRV 感染鳜鱼的致病机制，尤其是腹水形成的内在原因。
幽门盲囊的感染特征与病毒分布
通过 necropsy 观察、实时定量 PCR（RT-qPCR）、免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）等实验发现，MRV 感染后，鳜鱼幽门盲囊出现严重充血水肿，其病毒载量显著高于其他组织。免疫荧光显示，MRV 主要定位于浆膜层，黏膜层等其他层病毒信号极少。感染后 1 天浆膜层开始轻度增生，3 天明显增生填充盲囊间隙，5 天则严重增生，表明浆膜层是 MRV 的主要感染部位。
单细胞 RNA 测序解析细胞组成
对未感染和 MRV 感染的鳜鱼幽门盲囊进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），经数据过滤后分别获得 4807 个和 10777 个细胞。通过 t-SNE 降维和无监督聚类，鉴定出 18 个细胞簇，分为上皮细胞、免疫细胞、基质细胞和红细胞。上皮细胞包括纤毛上皮细胞和分泌细胞；免疫细胞含 T/NK 细胞、粒细胞、巨噬细胞、B 细胞和单核细胞；基质细胞有成纤维细胞、内皮细胞、肌成纤维细胞和平滑肌细胞。感染后各细胞亚群的数量和比例发生显著变化。
上皮与基质细胞亚型分析
对上皮细胞重新聚类，鉴定出 12 个亚型，包括非分泌上皮细胞、分泌细胞、杯状细胞和肠神经系统细胞亚型。尽管上皮层未被 MRV 感染，但出现部分黏连、上皮脱落和炎症细胞浸润。基质细胞重新聚类为 6 种类型，感染后内皮细胞、肌成纤维细胞和未定义基质细胞显著增加，其他细胞不同程度减少。病理观察显示，浆膜层因细胞外基质（ECM）沉积和重塑出现严重充血、水肿和增生。
免疫细胞亚群的组成与功能
免疫细胞重新聚类为 6 个亚型，健康鳜鱼中 T 细胞和 B 细胞是主要免疫细胞。MRV 感染后，巨噬细胞和粒细胞数量显著增加，T 细胞减少，B 细胞数量基本不变。荧光原位杂交（FISH）证实粒细胞和巨噬细胞 / 单核细胞在增生浆膜区富集。感染后免疫相关基因表达上调，多种促炎细胞因子如 IL-1β、IL-8、IL-6 和 IFNG 水平升高，引发炎症反应。
感染细胞的空间定位
利用空间转录组学（ST）分析增生浆膜的细胞组成，发现其主要由成纤维细胞、内皮细胞、单核 / 巨噬细胞、T 细胞、粒细胞和红细胞组成。免疫荧光扫描证实 MRV 主要位于增生浆膜区，揭示了病毒感染的空间特异性及浆膜层细胞的异质性。
MRV 的靶细胞鉴定
通过 scRNA-seq 和免疫荧光双染色等技术，证实 MRV 主要感染 B 细胞、T 细胞、肌成纤维细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞。透射电镜（TEM）在这些细胞中观察到病毒颗粒，而粒细胞、巨噬细胞 / 单核细胞和红细胞未被感染。
浆膜纤维化与胶原形成
MRV 感染导致浆膜层纤维化，Masson 染色显示增生浆膜充满胶原纤维构成的血管样结构。宿主编码的 V 型胶原基因（Col5a2a 和 Col5a3a）表达显著增加，同时 MRV 基因组编码 4 种胶原样蛋白（pORF011、pORF033、pORF067、pORF068），参与 ECM 形成。感染后期，胶原结构松散，间质液渗漏至腹腔，可能导致腹水形成。
讨论与结论
本研究首次在单细胞分辨率下全面解析了鳜鱼幽门盲囊对 MRV 急性感染的应答。结果表明，MRV 感染首先靶向浆膜层，引发纤维蛋白性浆膜炎，招募大量免疫和基质细胞，驱动 ECM 形成和血管重塑。T 细胞、B 细胞、成纤维细胞等作为靶细胞，促进炎症反应和纤维化，最终导致腹水和死亡。研究还发现 MRV 编码的胶原样蛋白参与宿主 ECM 构建，为病毒复制提供微环境。这些发现深化了对 MRV 致病机制的认识，为鱼类蛙病毒病的防治提供了新靶点和理论依据。
