免疫传感器表面功能化优化及检测效率提升策略研究

为解决免疫传感器 transducer 表面覆盖不均及抗体定向固定问题，研究人员通过原子力显微镜（AFM）和 X 射线光电子能谱（XPS）系统优化功能化步骤。在光学免疫传感器中实现灵敏度提升 19%、检测限降低 16%，为同类传感器优化提供通用策略。

　　

在生物医学检测领域，免疫传感器（Immunosensors）凭借抗体的高特异性成为疾病诊断的重要工具。然而，其性能瓶颈长期困扰研究者：传统方法中传感器表面功能化过程难以实现均匀覆盖，抗体（如 IgG1 单抗）固定存在随机取向和空间位阻问题，导致 analyte 识别效率低下，灵敏度和检测限（Limit of Detection, LOD）难以突破。例如，直接物理吸附法因稳定性差、覆盖率不可控，化学偶联法虽引入醛基（-CHO）、氨基（-NH?）等基团改善结合，但仍存在表面不均一、蛋白变性风险。如何通过系统优化表面功能化步骤，平衡抗体密度与定向性，成为提升免疫传感器性能的关键科学问题。

为攻克这一难题，西班牙研究团队以光学免疫传感器为模型，针对白细胞介素 - 6（Interleukin-6, IL6）检测展开研究。他们开发了一种基于原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）和 X 射线光电子能谱（X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS）的表面分析策略，通过逐步解析硅晶圆（SiW）功能化各阶段的形貌和化学组成，优化氨基硅烷（APTES）修饰、戊二醛（Glu）交联、牛血清白蛋白（BSA）封闭及抗 IL6 抗体固定的关键参数。研究成果发表于《Applied Surface Science》，为免疫传感器的性能提升提供了新范式。

研究采用的核心技术包括：

1. 表面功能化与表征：通过化学气相沉积（CVD）在 SiW 表面接枝 APTES 形成氨基层（SiW-NH?），经戊二醛交联生成醛基表面（SiW-CHO），再通过不同浓度 BSA 封闭非特异性位点，最终偶联抗 IL6 抗体（SiW-IgG1）。利用 AFM 监测表面粗糙度（R_q）变化，XPS 分析元素组成及化学态。
2. 检测性能评估：基于 AVAC 技术（单等离子体纳米颗粒计数），通过 IL6 抗原 - 抗体结合实验，量化金纳米颗粒（GNPs）信号，构建校准曲线并计算灵敏度和检测限。

3.1 功能化表面的表征

AFM 结果显示，原始 SiW 表面粗糙度仅 0.16 nm，APTES 修饰后 R_q升至 1.17 nm，表明氨基层形成；戊二醛交联后粗糙度进一步增加至 1.76 nm，提示醛基层覆盖但不均一；10 mg/mL BSA 封闭后 R_q降至 0.72 nm，表面均匀性显著改善；抗体固定后 R_q达 1.44 nm，局部仍存在纳米级未覆盖区域。XPS 证实，功能化各阶段碳（C）、氮（N）含量逐步增加，硅（Si）含量降低，其中 SiW-IgG1 的 N 1s 峰增强，表明抗体成功偶联。

3.2 封闭步骤的优化

对比 1、10、100 mg/mL BSA 浓度发现，高浓度 BSA（100 mg/mL）虽进一步降低粗糙度至 0.30 nm，但灵敏度从 62.05 counts/(pg?mL^-1) 降至 57.57 counts/(pg?mL^-1)，检测限（LOD）从 439 fg/mL 降至 177 fg/mL 后又升至 245 fg/mL。综合平衡，10 mg/mL BSA 为最优浓度，既减少非特异性吸附，又避免过度封闭影响抗体结合位点。

3.3 交联步骤的 pH 调控

将戊二醛交联 pH 从 7.3 调至 8.8 后，AFM 显示表面粗糙度降至 1.43 nm，相图均匀性显著提升，未检测到裸露基底区域。XPS 表明 Si 2p 含量从 30.5% 降至 25.0%，覆盖度提高。相应地，免疫传感器灵敏度提升 19%（从 59.27 至 70.46 counts/(pg?mL^-1)），检测限降低 16%（从 177 fg/mL 至 153 fg/mL），证实碱性条件促进醛基均匀覆盖，增强抗体结合效率。

研究通过系统优化免疫传感器表面功能化流程，揭示了表面均匀性对检测性能的决定性作用。关键发现包括：

1. 抗体密度非越高越好：盲目增加抗体浓度（如从 7 μg/mL 至 23 μg/mL）会导致灵敏度下降 48%，提示空间位阻效应显著。
2. 封闭与交联的动态平衡：10 mg/mL BSA 可有效封闭非特异性位点，同时保留足够抗体结合空间；碱性条件（pH 8.8）通过促进硅烷水解 - 缩合反应，形成均匀醛基层，提升抗体定向固定效率。
3. 通用优化策略：AFM/XPS 联用技术可广泛应用于各类基于抗体功能化的免疫传感器，实现灵敏度提升 15%-20%，为临床即时检测（POCT）中低丰度生物标志物（如细胞因子）的精准检测提供技术支撑。

该研究突破了传统免疫传感器优化依赖经验试错的局限，建立了基于表面物理化学特性的理性设计框架。通过分子水平的功能化调控，不仅为 IL6 等炎症因子的超灵敏检测奠定基础，也为癌症标志物、自身抗体等检测场景提供了可复制的优化路径，有望推动免疫传感器在精准医疗中的广泛应用。