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为探究 LPS 诱导呼吸道上皮屏障损伤机制，研究人员以 Calu-3 细胞、人原代支气管上皮前体细胞（PBEPCs）等为模型，研究 Cx26 半通道活性。发现 LPS 通过 TLR4/TNF-α/Ca2?信号增强 Cx26 半通道活性，CVB4-57 可拮抗此效应，为炎症性屏障保护提供新方向。
论文解读
在人体呼吸系统中，呼吸道上皮作为抵御外界病原体的第一道防线，其屏障功能的稳定至关重要。然而，当革兰氏阴性细菌感染时，其释放的脂多糖（LPS，一种病原体相关分子模式 PAMPs）会引发强烈的炎症反应，导致上皮屏障功能受损，进而引发肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。目前，LPS 损伤呼吸道上皮屏障的具体分子机制尚未完全明确，尤其是连接蛋白（connexin, Cx）家族在其中的作用亟待深入研究。连接蛋白是一类跨膜蛋白，其形成的半通道（hemichannel）在细胞间通讯和物质交换中扮演关键角色，已有研究提示 Cx 半通道活性在炎症条件下可能发生改变，但 Cx26 半通道在 LPS 诱导的呼吸道上皮损伤中的具体作用尚不清晰。
为了揭示这一科学问题，德国汉诺威莱布尼茨大学（Leibniz University Hannover）等机构的研究人员开展了系列研究。他们以人肺腺癌上皮细胞系 Calu-3、人原代支气管上皮前体细胞（PBEPCs）以及人精准切割肺切片（PCLS）为研究模型，结合分子生物学、细胞生物学及结构生物学技术，系统探究了 LPS 对 Cx26 半通道活性的调控机制及其与上皮屏障功能的关系，相关研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》。
研究主要采用了以下关键技术方法：
- 细胞培养与处理：培养 Calu-3 细胞和 PBEPCs，通过 siRNA 敲低 Cx26 或 Cx43 表达，利用不同浓度 LPS（10 ng/mL 至 1 μg/mL）处理细胞。
- 半通道活性检测：采用溴化乙锭（EtdBr）摄取实验检测 Cx 半通道活性，通过荧光强度变化评估通道开放程度。
- 屏障功能评估：利用跨上皮电阻（TEER）测量和紧密连接组织速率（TiJOR）分析，评估 LPS 对 Calu-3 细胞屏障功能的影响。
- 分子对接与结构分析：运用分子对接技术模拟小分子 CVB4-57 与 Cx26 的相互作用，结合冷冻电镜（cryo-EM）结构数据解析结合模式。
- 信号通路验证：通过抑制剂（如 C34 抑制 TLR4、Marimastat 抑制 TNF-α 分泌）和 Ca2?螯合剂（BAPTA-AM）验证 TLR4/TNF-α/Ca2?信号通路的作用。
研究结果
1. LPS 增强呼吸道上皮细胞 Cx26 半通道活性
在 Calu-3 细胞和 PBEPCs 中，LPS 处理显著增加 EtdBr 摄取率，表明 Cx 半通道活性增强。该效应具有浓度依赖性，10 ng/mL LPS（接近感染相关浓度）即可诱导显著变化，且依赖于 TLR4 受体激活。siRNA 敲低 Cx26 可完全抑制 LPS 诱导的 EtdBr 摄取增加，而敲低 Cx43 无此效果，证实 Cx26 半通道是 LPS 作用的主要靶点。此外，在人 PCLS 中，LPS 处理后气道上皮 Cx26 蛋白表达显著上调，进一步验证了体内相关性。
2. TLR4/TNF-α/Ca2?信号通路介导 LPS 对 Cx26 半通道的调控
机制研究发现，LPS 通过 TLR4 受体激活下游 TNF-α 分泌，TNF-α 可直接增强 Cx26 半通道活性，且该效应依赖于细胞内 Ca2?浓度升高。抑制 TLR4（C34）、阻断 TNF-α 分泌（Marimastat）或螯合胞内 Ca2?（BAPTA-AM）均能显著抑制 LPS 诱导的 Cx26 半通道开放，揭示了 LPS→TLR4→TNF-α→Ca2?→Cx26 的信号传导链。
3. Cx26 半通道活性增强导致上皮屏障功能损伤
LPS 处理可显著降低 Calu-3 细胞的 TEER 值，表明屏障功能受损。高浓度 LPS（1 μg/mL）处理 3 小时后，TEER 降低 35%，紧密连接蛋白 Claudin-4（CLDN4）的 TiJOR 降低 75%，且 CLDN4 从细胞膜向细胞核重新分布。低浓度 LPS（10 ng/mL）重复处理三次后，TEER 逐渐下降，CLDN4 TiJOR 持续降低，提示多次低剂量刺激可累积损伤屏障功能。值得注意的是，即使 TEER 部分恢复，CLDN4 的定位异常仍持续存在，表明存在 “分子瘢痕” 效应。
4. 小分子 CVB4-57 拮抗 Cx26 半通道活性并保护屏障功能
分子对接显示，CVB4-57 可结合于 Cx26 半通道的两个疏水口袋（N 端螺旋与跨膜结构域 TM1 界面），抑制通道开放。功能实验证实，CVB4-57 可剂量依赖性地降低 LPS 诱导的 EtdBr 摄取率，并显著减轻 LPS 导致的 TEER 下降和 CLDN4 TiJOR 降低，无论是高浓度单次刺激还是低浓度重复刺激，均表现出保护效应，且对正常细胞的间隙连接无影响，提示其具有较高的特异性和安全性。
研究结论与讨论
本研究首次系统阐明了 LPS 通过 TLR4/TNF-α/Ca2?信号通路激活 Cx26 半通道，导致呼吸道上皮紧密连接蛋白重塑和屏障功能损伤的分子机制，并发现小分子抑制剂 CVB4-57 可通过靶向 Cx26 半通道逆转这一过程。研究结果揭示了 Cx26 半通道作为 LPS 诱导上皮损伤的关键分子节点，其持续激活可能形成 “分子瘢痕”，使呼吸道上皮在感染后持续处于易损状态，这为解释慢性炎症性肺病的迁延不愈提供了新视角。
CVB4-57 的发现为临床治疗提供了潜在靶点，其通过抑制 Cx26 半通道活性，不仅能急性阻断 LPS 的损伤效应，还能预防重复炎症刺激导致的屏障累积损伤，为开发针对感染性和炎症性呼吸道疾病（如细菌性肺炎、慢性阻塞性肺疾病）的新型治疗策略奠定了基础。未来研究可进一步探索 CVB4-57 的体内药效和安全性，以及 Cx26 半通道在其他组织器官炎症损伤中的作用，拓展其临床应用前景。
