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为探究溶细胞颗粒（LG）生物发生机制，研究者聚焦细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL），发现纤毛蛋白 IFT20 通过调控阳离子非依赖甘露糖 - 6 - 磷酸受体（MPR）逆向运输，确保颗粒酶 B（GZMB）定位于 LG。IFT20 缺陷导致 CTL 杀伤能力受损，且揭示 TFEB 对溶酶体与 LG 基因的共调控作用，为免疫相关疾病提供新视角。
在免疫应答的精密网络中，细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）作为清除病毒感染和肿瘤细胞的 “杀手”，依赖溶细胞颗粒（lytic granules, LG）释放穿孔素（perforin, PRF）、颗粒酶（granzymes, GZMs）等细胞毒性分子执行功能。然而，LG 的生物发生路径及其调控机制仍存诸多谜团，尤其是不同囊泡运输通路如何协同作用、关键调控因子如何精准控制 LG 的组装与功能等问题，制约着人们对 CTL 免疫应答机制的深入理解。此外，人类原发性免疫缺陷中 CTL 功能异常与 LG 组件（如 PRF）及生物发生调控因子（如 AP3B1）的突变密切相关，解析 LG 生物发生的分子机制对揭示免疫疾病的发病原理至关重要。
为破解这些科学难题，意大利锡耶纳大学（University of Siena）的研究团队开展了一系列研究，相关成果发表在《Cell Death and Disease》。该研究首次发现纤毛蛋白 IFT20（intraflagellar transport 20）在 LG 生物发生中的关键作用，并揭示转录因子 TFEB（transcription factor EB）对 LG 组件基因表达的调控网络，为 CTL 免疫功能调控机制提供了新范式。
研究者主要采用了以下关键技术方法：
- 基因编辑与敲低技术：利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 IFT20 敲除（IFT20 KO）的人类 CTL，通过 siRNA 介导 IFT20 和 TFEB 的敲低（KD），以研究基因功能。
- 免疫荧光与共定位分析：通过免疫荧光染色标记 MPR、TGN38、GZMB-mCherry、LAMP1 等分子，结合共聚焦显微镜观察和 Manders’系数分析，追踪蛋白定位与囊泡运输路径。
- 细胞毒性实验：采用钙黄绿素 - AM 释放实验，检测 CTL 对靶细胞的杀伤能力，评估 IFT20 和 TFEB 缺陷对 CTL 功能的影响。
- RT-qPCR 与染色质免疫沉淀（ChIP）：分析溶酶体相关基因（如 LAMP1、CTSD）和 LG 组件基因（如 GZMA、GZMB、PRF）的转录水平，验证 TFEB 与目标基因启动子的结合。
研究结果
1. IFT20 调控 MPR 逆向运输与 GZMB 靶向 LG
在 IFT20 KO CTL 中，MPR 向反式高尔基体网络（TGN）的逆向运输受损，导致 GZMB 在 TGN38 区室积累，与溶酶体 / LG 标记物 LAMP1 及 PRF 的共定位减少。细胞毒性实验表明，IFT20 缺陷显著削弱 CTL 对靶细胞的杀伤能力，提示 IFT20 通过确保 MPR 依赖的 GZMB 定位维持 LG 功能。
2. IF123T20 缺乏引发 LG 形态异常与基因表达补偿
IFT20 KO CTL 中 LG 数量减少、体积增大，呈现类似溶酶体功能障碍的形态特征。RT-qPCR 显示，溶酶体生物发生相关的 CLEAR 网络基因（如 LAMP1、CTSD、TFEB）及 LG 组件基因（GZMA、GZMB、PRF、SRGN、GNLY）表达上调，暗示 CTL 通过转录补偿试图恢复 LG 功能。
3. TF45EB 协调溶酶体与 LG 基因的共转录调控
通过 JASPAR 软件预测及 ChIP 实验验证，TFEB 结合于 GZMA、GZMB、PRF 等 LG 组件基因启动子。过表达 TFEB 显著上调 CLEAR 网络基因和 LG 组件基因，而 TFEB 敲低则导致相关基因表达下降及 LG 数量减少，证实 TFEB 对 LG 生物发生的转录调控作用。
4. IF67T20 通过 mTOR 通路调控 TFEB 核转位
IFT20 缺陷导致 mTOR 磷酸化水平降低，促进 TFEB 核转位。使用 mTOR 抑制剂 Torin1 处理 CTL 可模拟 IFT20 缺乏的效应，进一步证明 IFT20 通过维持 mTOR 活性抑制 TFEB 过度激活，从而平衡溶酶体与 LG 的生物发生。
研究结论与意89义
本研究揭示了 IFT20 在 CTL 中作为 LG 生物发生的关键调控因子，通过协调 MPR 依赖的 GZMB 运输至 LG，确保 CTL 杀伤功能。同时，研究首次证实 TFEB 通过调控扩展的 CLEAR 网络，同步控制溶酶体与 LG 组件基因的表达，为 LG 异质性和 CTL 功能调控提供了新机制。
该发现不仅深化了对 CTL 免疫应答分子机制的理解，还为原发性免疫缺陷（如 PRF 相关疾病）及肿瘤免疫治疗提供了潜在靶点。例如，调控 IFT20-TFEB 通路可能成为增强 CTL 杀伤能力或纠正溶酶体功能障碍的新策略。此外，研究提出的 LG 生物发生与纤毛蛋白的关联，为探索其他溶酶体相关细胞器（如黑色素体、血小板 α 颗粒）的调控机制提供了跨学科启示。
未来研究可进一步解析 IFT20 在 LG 亚群（如单核心颗粒与多核心颗粒）分化中的作用，以及 TFEB 与其他转录因子（如 RUNX3、T-BET）的协同网络，为精准干预 CTL 功能开辟新方向。
