牙菌斑生物膜中DNase I抗性的Z-DNA和G-四联体结构及其酶解新策略

本研究针对牙菌斑生物膜中胞外DNA（eDNA）形成的非经典结构（Z-DNA和G-四联体）导致传统DNase I失效的难题，通过免疫荧光标记和共聚焦显微技术，首次在健康人群和龋病患者的牙菌斑中发现这些抗性结构，并开发出能有效降解这些结构的实验性核酸酶DNase A和DNase I-氯喹组合方案。该研究为开发靶向非经典DNA结构的酶制剂提供了新思路，对改善口腔生物膜控制和龋病防治具有重要意义。

　　

在口腔健康领域，牙菌斑生物膜就像一座顽固的"微生物城堡"，其复杂的胞外基质中包含着一类特殊的防御工事——非经典DNA结构。传统观点认为，生物膜中的胞外DNA（eDNA）主要以经典的B型双螺旋结构存在，容易被哺乳动物DNase I降解。然而近年研究发现，eDNA还能形成Z-DNA（左旋双螺旋）和G-四联体（G4，鸟嘌呤富集区的特殊折叠）等"分子变形金刚"，这些结构对DNase I具有惊人的抗性。更棘手的是，全球约30亿人受龋病困扰，而牙菌斑生物膜正是主要诱因之一。面对这一挑战，来自丹麦奥胡斯大学等机构的研究团队开展了一项开创性研究，成果发表在《npj Biofilms and Microbiomes》上。

研究人员采用免疫荧光标记结合共聚焦显微技术，分析健康人群和龋病患者的牙菌斑样本；建立链球菌突变体（S. mutans）悬浮聚集体生物膜模型；通过时间序列成像定量评估不同核酸酶处理效果；采用pH比率测定法分析酶处理对生物膜酸性的影响。关键技术包括：BG4抗体标记G4结构、Z22抗体标记Z-DNA、SYTOX Green染色eDNA、C-SNARF-4荧光探针pH检测等。

【G4和Z-DNA存在于健康受试者的牙菌斑生物膜中】
通过特异性抗体标记，在6/10健康受试者的牙菌斑中检测到G4结构，9/10检出Z-DNA。这些非经典结构以两种形式存在：一是环绕细菌簇的同心环状结构（内层为Z-DNA/G4，外层为B-DNA）；二是直接附着于细菌表面，尤其多见于杆状菌或类真菌菌丝的大型细胞。

【G4和Z-DNA也存在于龋病活跃者的牙菌斑中】
在龋病患者样本中，6/10检出G4，7/10检出Z-DNA。其分布模式与健康组相似，但存在明显异质性——这些结构仅占生物膜的小部分区域，提示局部微环境促进其形成。

【G4和Z-DNA结构抵抗DNase I降解】
比较实验显示，经DNase I处理后，G4和Z-DNA结构依然存在。令人意外的是，与之相邻的B-DNA也未被完全清除，暗示这些结构可能形成保护性"超结构"。DNase I活性验证实验排除了酶失活的可能性。

【链球菌突变体聚集体生物膜模型富含eDNA、G4和Z-DNA】
突破性地发现，S. mutans在液体悬浮培养时会形成富含eDNA的聚集体，其Z-DNA主要分布在聚集体表面。该模型表型稳定，克服了传统固-液界面培养的局限性，成为量化酶解效果的理想平台。

【实验性核酸酶DNase A有效清除抗性eDNA】
时间序列成像显示，DNase I处理1小时后仍残留抗性eDNA。筛选发现：微球菌核酸酶效果不稳定；DNase I+氯喹（Z-DNA转化剂）组合可显著清除抗性eDNA；新型DNase A对合成G4和Z-DNA底物降解率分别达75%和>99%，在生物膜中也表现优异。

【酶处理不影响生物膜酸性】
尽管eDNA带负电荷可能捕获质子，但pH比率测定显示，各种酶处理均未改变S. mutans生物膜的强产酸特性，提示eDNA清除不会直接影响龋病相关的局部酸化过程。

这项研究首次证实：人类牙菌斑中存在DNase I抗性的Z-DNA和G4结构；开发出能靶向这些结构的DNase A和DNase I-氯喹组合方案；建立的S. mutans聚集体模型为后续研究提供有力工具。其重要意义在于：①揭示非经典DNA结构是生物膜基质的重要组分，解释为何传统DNase I对成熟生物膜失效；②为开发新型酶制剂指明方向——需同时靶向多糖和不同DNA结构；③提示局部"热点"区域的特殊结构可能与龋病发生相关，未来可探索这些结构与致龋菌群的空间关联。正如研究者强调，这项发现不仅适用于口腔健康领域，对其他含非经典DNA结构的生物膜控制也具有普适性启示。