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尿道失禁治疗中 ANO1 通道作为潜在靶点的作用尚不明确。研究人员针对小鼠尿道平滑肌（USMC），探究 ANO1 通道表达及对激动剂 / 神经诱发活动的影响。发现 ANO1 虽表达于 USMC，但不参与基础 Ca2?信号及相关收缩，为尿道功能研究提供新方向。
尿道是泌尿系统的重要组成部分，其平滑肌的收缩功能对于维持正常的排尿控制至关重要。在尿道平滑肌细胞（USMC）中，钙激活氯离子通道 ANO1（Anoctamin-1）被认为可能参与调节平滑肌的收缩性，进而影响尿道张力和尿失禁等疾病的发生。然而，关于 ANO1 在尿道平滑肌中的具体细胞表达模式及其对激动剂和神经诱发收缩的贡献，目前的研究结果尚存在争议。例如，不同物种间 ANO1 的表达细胞类型存在差异，且以往研究中使用的药物可能存在脱靶效应，导致结论不够明确。因此，明确 ANO1 在小鼠尿道平滑肌中的作用，对于理解尿道功能调控机制及开发针对尿失禁的靶向治疗方法具有重要意义。
为解决上述问题，来自爱尔兰邓多克理工学院（Dundalk Institute of Technology）和美国内华达大学雷诺医学院（University of Nevada, Reno School of Medicine）的研究人员开展了相关研究。他们通过分子生物学、免疫组织化学、电生理学和药理学等方法，系统分析了 ANO1 在小鼠尿道中的表达及其功能作用。研究结果表明，尽管 ANO1 在小鼠尿道平滑肌细胞中表达，但其并不参与基础 Ca2?信号传导，也不影响激动剂（如苯肾上腺素、精氨酸加压素）和神经刺激诱发的收缩。该研究为尿道平滑肌收缩的分子机制提供了新的见解，并对将 ANO1 作为尿失禁治疗靶点的可能性提出了新的思考。研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究中主要使用的关键技术方法包括：
- 定量聚合酶链反应（qPCR）：用于检测小鼠尿道组织中 Ano1 转录本的表达水平，以 β- 肌动蛋白（β-actin）为内参基因，比较雄性和雌性尿道组织及近端结肠（阳性对照）的表达差异。
- 免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）：利用特异性抗体检测 ANO1 蛋白在尿道平滑肌细胞和间质细胞（如 c-kit? Cajal 样间质细胞（ICC-LC）、PDGFRα?细胞）中的定位，验证其细胞表达模式。
- 钙成像（Ca2? imaging）：使用 Acta2-GCaMP8.1 小鼠和 Kit-GCaMP6f 小鼠，通过共聚焦显微镜观察尿道平滑肌细胞和结肠组织中 Ca2?信号的动态变化，分析 ANO1 抑制剂对 Ca2?事件频率、振幅、持续时间和空间传播的影响。
- 等长张力记录（isometric tension recordings）：检测尿道平滑肌环对苯肾上腺素（PE）、精氨酸加压素（AVP）等激动剂以及电场刺激（EFS）的收缩反应，评估 ANO1 抑制剂 Ani9 和 CaCCinhA01 对收缩幅度和基线张力的影响。
- 膜片钳记录（patch-clamp recording）：在转染人 ANO1 通道的 HEK 293 细胞中，检测 ANO1 特异性抑制剂 Ani9 对通道电流的抑制作用，验证药物的有效性。
研究结果
1. ANO1 在尿道组织中的表达
qPCR 结果显示，小鼠雄性和雌性尿道组织中均检测到 Ano1 转录本表达，且两者无显著差异，表达水平约为近端结肠的 2.9 倍。免疫组织化学表明，ANO1 蛋白主要表达于尿道平滑肌细胞，而在 c-kit? ICC-LC 和 PDGFRα?间质细胞中未检测到。免疫细胞化学进一步证实，分离的尿道平滑肌细胞中 ANO1 与平滑肌 α- 肌动蛋白共定位，而膀胱平滑肌细胞中无 ANO1 表达，海绵体平滑肌细胞中则有明确表达。
2. ANO1 抑制对尿道收缩的影响
在雄性小鼠尿道平滑肌环中，苯肾上腺素（PE）可浓度依赖性地诱导收缩，其 EC??值为 1.3 μM。然而，ANO1 特异性抑制剂 Ani9（3 μM）预处理后，PE 诱导的收缩幅度和曲线下面积（AUC）均未受影响，且对基线张力无显著作用。电场刺激（EFS）可诱发频率依赖性收缩，该反应可被河豚毒素（TTX）完全阻断，表明其为神经源性收缩。但 Ani9 预处理后，各频率下的 EFS 诱发收缩均未受抑制。
3. ANO1 抑制对尿道平滑肌 Ca2?信号的影响
利用 Acta2-GCaMP8.1 小鼠进行钙成像，发现尿道平滑肌细胞在基础状态下表现出异步的 Ca2?活动。Ani9 处理后，雄性和雌性尿道平滑肌细胞的 Ca2?事件频率、振幅、持续时间和空间传播均无显著变化，表明 ANO1 不参与基础 Ca2?信号传导。
4. Ani9 的有效性验证
在 HEK 293 细胞中，Ani9（100 nM）可显著抑制人 ANO1 通道电流，在 + 120 mV 时电流幅度从 2.8±0.4 nA 降至 0.3±0.1 nA。在小鼠近端结肠组织中，Ani9（3 μM）可有效抑制自发性相位收缩和 Ca2?信号，表明药物在其他组织中具有功能性活性，排除了药物无效的可能性。
5. 其他钙激活氯离子通道拮抗剂的作用
非选择性钙激活氯离子通道拮抗剂尼氟灭酸（niflumic acid）可显著抑制 EFS 和 AVP 诱发的尿道收缩，而另一种 ANO1 抑制剂 CaCCinhA01 则无显著作用。这提示可能存在其他类型的钙激活氯离子通道参与尿道收缩，但需注意尼氟灭酸的脱靶效应（如影响电压依赖性 Ca2?通道、肌浆网 Ca2?释放等）。
研究结论与讨论
本研究表明，在小鼠尿道中，ANO1 通道虽表达于尿道平滑肌细胞，但并不参与基础 Ca2?信号传导，也不影响激动剂或神经诱发的收缩。这一结果与兔等其他物种的研究存在差异，提示 ANO1 的功能具有物种特异性。以往研究中使用的非选择性拮抗剂可能因脱靶效应导致对 ANO1 作用的高估，而本研究采用高选择性抑制剂 Ani9，排除了这一干扰。
研究结果对尿道功能调控机制和尿失禁治疗具有重要意义。首先，否定了 ANO1 在小鼠尿道平滑肌收缩中的关键作用，为理解尿道张力的分子基础提供了新证据；其次，提示需重新评估 ANO1 作为尿失禁治疗靶点的潜力，尤其是在不同物种间的差异。未来研究可进一步探索其他钙激活氯离子通道或信号通路在尿道功能中的作用，以及 ANO1 在病理状态下的潜在功能变化。
本研究通过多学科技术手段，系统揭示了 ANO1 在小鼠尿道中的表达与功能，为泌尿系统平滑肌生物学研究提供了重要参考，也为相关疾病的药物开发提供了新的思路和方向。
