大麻潜隐类病毒(HLVd)微繁殖组织培养中的热疗根除疗法及差异基因表达分析

为解决大麻栽培中Hop Latent Viroid（HLVd）感染导致的产量与品质下降问题，研究人员通过结合茎尖培养与热疗法，在13个大麻品种中成功实现HLVd根除，并通过纳米孔长读长测序鉴定出与HLVd致病相关的差异表达基因（DEGs），包括细胞壁结构、防御信号通路等关键靶点。该研究为HLVd防控提供了分子机制依据和有效技术方案，成果发表于《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》。

　　

大麻（Cannabis sativa）作为重要的经济作物，其栽培面临Hop Latent Viroid（HLVd）的严重威胁。这种256碱基对的环状RNA病原体可导致植株矮化、花发育异常及次生代谢物（如大麻素和萜烯）含量下降，造成重大农业损失。尽管HLVd在1980年代已在啤酒花（Humulus lupus）中被发现，但其在大麻中的传播机制和分子病理学仍不明确。更棘手的是，HLVd感染初期常无症状，易通过机械传播（如修剪工具）扩散，而传统检测方法存在灵敏度不足的问题。因此，开发高效根除技术并解析其致病机制成为产业迫切需求。

Front Range Biosciences的研究团队在《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》发表论文，通过结合茎尖培养与30°C热疗法，成功在5个大麻品种中实现HLVd完全清除，并利用纳米孔长读长cDNA测序技术，首次揭示HLVd感染引发的宿主基因表达变化。研究为理解HLVd-大麻互作提供了分子基础，同时建立了可推广的病原防控方案。

研究采用三项关键技术：1）基于双重探针RT-qPCR（检测限0.0001 ng RNA）的HLVd定量分析；2）茎尖培养结合30°C/16周热疗法的病原清除体系；3）纳米孔测序（Oxford Nanopore）对感染/未感染组织的转录组比较。实验样本包括12个内部选育大麻品种和1个商业对照品种的微繁殖组织。

热疗法根除效果显著
通过优化热疗条件（30°C±2°C），研究在13个品种中观察到差异清除率：Athena清除率最高（94%），Annalee、FRB1.4和Wife分别达62%、69%和50%，而RiverRock和Pure CBG无响应。二次检测证实清除效果可持续数月，且植株存活率>70%。RT-qPCR显示清除组HLVd Ct值消失，而阳性组Ct值介于18-32（26S内参基因Ct=18-22），表明热疗法能稳定破坏病毒复制。

差异基因揭示致病机制
纳米孔测序鉴定出74个差异表达基因（DEGs），其中38个上调、36个下调。显著变化包括：

• 细胞结构重塑：扩张蛋白基因Expansin-like B1（LOC115716935）表达上调5.68倍，而糖原合成酶（LOC115715608）下调4.92倍，解释感染植株的茎秆脆性表型。
• 防御通路激活：钙调蛋白CML37（LOC115718923）和WRKY转录因子（LOC115702722）分别上调3.13倍和3.48倍，但病程相关蛋白PR-1（LOC115705814）下调4.26倍，显示HLVd可能抑制部分免疫应答。
• 代谢重编程：脂质转运蛋白（LOC115698126）和铁氧还蛋白（LOC115725758）表达显著降低，与植株生长迟缓表型相符。

讨论与意义
该研究首次证实热疗法结合茎尖培养可有效清除大麻HLVd，且清除效果具有品种依赖性。差异基因分析揭示了HLVd通过干扰细胞壁合成、防御信号和能量代谢通路致病的分子机制，特别是扩张蛋白和PR蛋白的异常表达与症状直接相关。纳米孔测序技术的应用克服了大麻基因组复杂性对转录组分析的干扰，为其他植物病毒研究提供方法学参考。

局限性在于部分差异基因功能未注释，且未验证基因敲除对症状的影响。未来研究可扩大品种测试范围，并开发基于关键DEGs（如Expansin B1）的分子标记辅助育种。该成果为大麻产业的病毒防控提供了理论与实践双重支撑，对保障全球大麻供应链安全具有重要意义。