分子剂量学视角下甲基丁香酚及其代谢物 1′- 羟基甲基丁香酚在人肝细胞模型中诱导 DNA 加合物形成、致断裂性和细胞毒性的研究

为探究甲基丁香酚（ES）的遗传毒性，研究人员以人 HepG2、HepG2-CYP1A2 细胞及原代人肝细胞（PHH）等为模型，研究 ES 及其代谢物 1′- 羟基甲基丁香酚（1′OH-ES）的毒性。发现 1′OH-ES 致 DNA 加合物水平更高，且存在触发致断裂性的 DNA 加合物阈值，为 ES 安全性评估提供依据。

　　

甲基丁香酚肝毒性机制研究：从 DNA 加合物到细胞损伤的剂量效应解密

在天然植物精油的安全性评估领域，甲基丁香酚（Estragole, ES）作为一种广泛存在于茴香、罗勒等草本植物中的苯丙烯类化合物，其潜在的肝毒性与致癌性一直是学术界关注的焦点。尽管国际癌症研究机构（IARC）尚未对其进行明确分类，但欧盟已因担忧其遗传毒性禁止将其作为食品添加剂。然而，目前关于 ES 在人体肝细胞中的定量遗传毒性数据，尤其是 DNA 加合物水平与致断裂性（Clastogenicity）等关键效应的关联性研究仍较为匮乏。例如，ES 经 CYP1A2 和 SULT1A1 代谢激活生成的 1′- 羟基甲基丁香酚（1′-hydroxyestragole, 1′OH-ES）如何引发 DNA 损伤，以及这种损伤是否存在剂量阈值，这些问题直接关系到对人类通过饮食或草药接触 ES 的风险评估。

为填补这一研究空白，德国凯撒斯劳滕 - Landau 大学（RPTU Kaiserslautern-Landau）食品化学与毒理学部门联合多个研究机构的科研团队，在《Archives of Toxicology》发表了题为 “Molecular dosimetry of estragole and 1′-hydroxyestragole-induced DNA adduct formation, clastogenicity and cytotoxicity in human liver cell models” 的研究论文。该研究通过多个人肝细胞模型，系统揭示了 ES 及其代谢物诱导 DNA 损伤的分子机制与剂量效应关系，为评估 ES 的人体暴露风险提供了关键科学依据。

研究技术方法概览

研究采用了多种关键技术手段：

1. 细胞模型构建：使用人肝癌细胞系 HepG2、稳定转导 CYP1A2 的 HepG2-CYP1A2 细胞，以及原代人肝细胞（Primary human hepatocytes, PHH）和原代大鼠肝细胞（PRH），模拟不同代谢能力的肝脏环境。
2. DNA 加合物检测：通过超高效液相色谱 - 串联质谱（UHPLC-MS/MS）定量分析主要 DNA 加合物 E3′-N²-dG 和 E3′-N⁶-dA 的水平。
3. 遗传毒性评估：利用碱性彗星试验检测 DNA 链断裂，通过蛋白质免疫印迹（Western blot）分析 γH2AX（DNA 损伤标志物）和 p53（肿瘤抑制蛋白）的表达，采用流式细胞术和微核试验（Micronucleus assay）评估染色体断裂效应。
4. 细胞毒性分析：通过刃天青还原法（Resazurin reduction assay）测定细胞活力，计算半数有效浓度（EC₅₀）。
5. 基准浓度建模（Benchmark Concentration, BMC）：运用 PROAST 软件对剂量 - 反应数据进行建模，确定引发关键效应的 DNA 加合物阈值。

研究结果与分析

1. DNA 加合物形成的浓度依赖性

• ES 的代谢激活：在 HepG2-CYP1A2 细胞中，ES（0–2 mM）诱导 E3′-N²-dG 加合物呈浓度依赖性增加，最高浓度（1 mM）时达 332 个加合物 / 10⁸核苷（ncs），但未检测到 E3′-N⁶-dA 加合物。
• 1′OH-ES 的强基因毒性：HepG2 细胞暴露于 1′OH-ES（0–35 μM）时，E3′-N²-dG 水平比等摩尔 ES 高 10–50 倍，且在最高浓度下检测到 E3′-N⁶-dA 加合物（139 个 / 10⁸ ncs）。

2. DNA 损伤响应与细胞毒性

• γH2AX 与 p53 的差异激活：ES 仅在 HepG2-CYP1A2 细胞中诱导适度 γH2AX 增加（3 倍于对照），未引起 p53 积累；而 1′OH-ES 在 HepG2 细胞中显著诱导 γH2AX（最高 4.8 倍）和 p53（7 倍），在 PHH 中 γH2AX 增加 3 倍，但 p53 水平下降。
• 细胞毒性的代谢物特异性：ES 在高达 5 mM 时对人肝细胞无毒性，而 1′OH-ES 在 HepG2 细胞中的 EC₅₀为 43 μM（24 h），且随时间延长毒性增强（72 h 时 EC₅₀降至 27 μM），PHH 对 1′OH-ES 的耐受性更高（EC₅₀=107 μM）。

3. 致断裂性与微核形成

• 染色体损伤的阈值效应：ES 在≥1 mM 时诱导微核（MN）形成（1.6 倍于对照），而 1′OH-ES 在≥25 μM 时即可引发显著 MN 增加（最高 4.6 倍）。流式细胞术和细胞分裂阻滞微核试验（CBMN）均证实，1′OH-ES 的致断裂性强于 ES。

4. 分子剂量学与基准浓度建模

• 加合物水平与效应的关联性：触发微核形成的 E3′-N²-dG 阈值为 240–2237 个 / 10⁸ ncs，而细胞毒性需更高水平（6881 个 / 10⁸ ncs）。BMC 建模显示，1′OH-ES 引发 DNA 加合物的基准浓度（2.7 μM）比 ES（63.3 μM）低 20–30 倍，且致断裂性的 BMC 比加合物形成高 12–17 倍。

研究结论与意义

本研究首次在人肝细胞模型中建立了 ES 代谢物诱导的 DNA 加合物水平与遗传毒性效应的定量关系，证实了触发致断裂性和细胞毒性需达到特定的 DNA 加合物阈值。尽管 ES 在啮齿类动物中显示致癌性，但其在人类通过饮食或草药的慢性暴露下，DNA 加合物水平远低于引发损伤的阈值，提示常规暴露风险较低。此外，研究揭示了 1′OH-ES 作为关键代谢物的强基因毒性机制，为苯丙烯类化合物的风险评估提供了分子剂量学模型。未来研究可进一步探索人类肝细胞中 DNA 加合物的修复机制及其与 SULT1A1 等代谢酶多态性的关联，以完善 ES 的个体风险评估体系。

这项研究不仅深化了对天然毒素肝毒性机制的理解，也为食品添加剂和草药的安全性评价提供了重要的方法学参考，有助于在保障传统植物资源利用的同时，科学管控潜在健康风险。