Bacillus paralicheniformis AUMC B-516产L-天冬酰胺酶的优化生产、纯化及其对MCF-7乳腺癌细胞系的强效细胞毒性研究

本研究针对当前临床L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)治疗存在的过敏反应、神经毒性等问题，从Bacillus paralicheniformis AUMC B-516菌株中优化生产并纯化获得高活性L-天冬酰胺酶。通过两阶段色谱纯化获得比活性达4087.6 U/mg的酶制剂，证实其对MCF-7乳腺癌细胞具有显著细胞毒性(IC50 49.3 μg/mL)，且DNA片段化率达22.2%，与阳性对照阿霉素相当。该研究为开发新型抗癌生物制剂提供了潜在候选。

　　

在癌症治疗领域，L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)作为一种重要的抗癌酶制剂，已被广泛应用于急性淋巴细胞白血病等血液系统恶性肿瘤的治疗。然而，目前临床主要采用的Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi来源的L-天冬酰胺酶存在诸多局限性：包括过敏反应、抗原性、半衰期短以及伴随的L-谷氨酰胺酶活性导致的神经毒性等问题。这些副作用严重限制了该酶的临床应用效果。与此同时，针对实体瘤特别是乳腺癌的治疗中，L-天冬酰胺酶的应用潜力尚未充分开发。寻找新型微生物来源、具有更高特异性和更低毒副作用的L-天冬酰胺酶成为当前研究热点。

针对这一科学问题，来自埃及Assiut大学等多个机构的研究团队开展了一项创新性研究，他们从环境样本中分离获得一株Bacillus paralicheniformis AUMC B-516菌株，对其产L-天冬酰胺酶的条件进行系统优化，并通过多步纯化获得高纯度酶制剂。研究团队进一步评估了该酶的抗癌活性及其作用机制，相关成果发表在《AMB Express》期刊上。这项研究不仅为微生物源L-天冬酰胺酶的生产提供了新思路，也为开发针对乳腺癌等实体瘤的新型生物治疗药物奠定了重要基础。

研究人员采用了多种关键技术方法开展研究：通过16S rRNA基因测序对菌株进行分子鉴定；采用单因素优化法(OFAT)确定最佳发酵条件；利用DEAE-纤维素离子交换层析和Sephacryl S200 HR凝胶过滤层析进行酶纯化；通过MTT法测定细胞毒性；采用流式细胞术和DNA片段化分析评估凋亡效应；运用分子对接技术分析酶与底物的相互作用；并通过小鼠模型进行体内毒性评估。

在菌株鉴定与发酵优化部分，研究通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，确认分离菌株为Bacillus paralicheniformis，命名为AUMC B-516。优化实验显示，该菌株在pH 8.0、35°C条件下，以0.2%葡萄糖和1.0% L-天冬酰胺为底物，发酵48小时可获得最高酶活(116.4 U/mL)。值得注意的是，研究发现在发酵培养基中无需添加其他氮源，仅需L-天冬酰胺即可获得最佳产量，这一发现对降低生产成本具有重要意义。

在酶纯化与表征部分，研究采用乙醇沉淀结合两步层析法(DEAE-纤维素和Sephacryl S200 HR)进行纯化，最终获得12倍纯化的酶制剂，比活性达到4087.6 U/mg，回收率为3.4%。SDS-PAGE分析显示纯化酶的分子量约为43.98 kDa。酶学性质研究表明，该酶在pH 8.0和37°C条件下活性最高，且K⁺和Na⁺对其活性有显著激活作用。动力学分析显示，该酶对L-天冬酰胺的亲和力最高(K_m 6.22×10^-2 mM)，而对L-谷氨酰胺的活性较低，这一特性有助于减少治疗中的神经毒性副作用。

在分子对接分析部分，研究预测了B. paralicheniformis L-天冬酰胺酶的三维结构，并分析了其与底物L-天冬酰胺的相互作用。结果显示该酶与L-天冬酰胺的结合自由能(ΔG)为-3.8 kcal/mol，主要通过Leu14和Asn18等残基形成氢键。特别值得注意的是，该酶对肝脏型谷氨酰胺酶的结合亲和力(-203)高于肾脏型(-162.08)，这种组织特异性可能为开发靶向治疗策略提供新思路。

在抗癌活性评估部分，研究采用MCF-7人乳腺癌细胞系评估了纯化L-天冬酰胺酶的细胞毒性。结果显示，该酶对MCF-7细胞具有剂量依赖性细胞毒性，IC₅₀为49.3 μg/mL。流式细胞术分析表明，随着酶浓度增加(10-50 μg/mL)，晚期凋亡细胞比例从0.02%显著增加至46.67%。基因表达分析显示，酶处理可显著下调抗凋亡基因BCL-2，上调促凋亡基因BAX和p53。DNA片段化实验证实，酶处理组的DNA片段化率(22.2±1.36%)与阳性对照阿霉素(23.9±0.93%)相当，显著高于阴性对照组(8.9±0.83%)。

在安全性评估部分，研究通过小鼠模型考察了该酶的体内毒性。结果显示，虽然天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性略有升高，但血糖、电解质水平和肾功能指标均保持正常，血液学参数也在正常范围内，表明该酶具有较好的安全性。

综合研究结果，可以得出以下重要结论：Bacillus paralicheniformis AUMC B-516是一株高产L-天冬酰胺酶的菌株，通过优化发酵条件和建立高效纯化工艺，可获得高纯度、高活性的酶制剂；该酶对L-天冬酰胺具有高度特异性，且对L-谷氨酰胺的活性较低，这一特性有助于减少治疗相关的神经毒性；体外实验证实该酶对MCF-7乳腺癌细胞具有显著细胞毒性和促凋亡作用，其效果与临床常用抗癌药阿霉素相当；体内安全性评估显示该酶毒性较低，具有良好的临床应用前景。

这项研究的科学意义主要体现在三个方面：首先，发现了一种新型微生物来源的L-天冬酰胺酶生产菌株，丰富了酶制剂生产的微生物资源库；其次，建立了高效的发酵和纯化工艺，为工业化生产奠定了基础；最重要的是，证实了该酶对乳腺癌细胞的显著抗癌活性，为拓展L-天冬酰胺酶在实体瘤治疗中的应用提供了实验依据。与现有商业酶制剂相比，该酶具有产量高、特异性好、毒性低等优势，有望发展成为新一代抗癌生物制剂。未来研究可进一步优化酶的性质，开展临床前药效学和药代动力学评价，推动其向临床应用转化。