Aspergillus austroafricanus诱导Lysinibacillus macroides高产异环蒽素样细菌素的培养基优化及其应用潜力评估

本研究针对食品和农业领域对抗菌剂和抗氧化剂的迫切需求，通过响应面法(RSM)优化培养基条件，成功实现Aspergillus austroafricanus诱导Lysinibacillus macroides异环蒽素样细菌素(heterocycloanthracin-like bacteriocin)的48.7倍增产。该10.5 kDa的"macroidin"具有广谱抗菌活性(对Listeria monocytogenes MIC达0.98μg/mL)和媲美抗坏血酸的抗氧化能力(DPPH清除率89.67%)，为食品生物防腐和植物病原体防控提供了新型生物制剂。

　　

在当今全球面临抗生素耐药性危机和食品安全挑战的背景下，寻找新型生物活性化合物成为科研热点。每年因耐药菌感染导致的死亡人数持续攀升，预计将超过1000万例，而食品腐败造成的经济损失高达数十亿美元。传统化学防腐剂带来的健康隐患和消费者对"清洁标签"产品的需求，使得微生物源抗菌肽——特别是具有多重功能的细菌素(bacteriocin)成为研究焦点。然而，细菌素工业化应用面临两大瓶颈：天然菌株产量低下（通常<0.1g/L）和活性谱较窄。这些问题促使科学家将目光投向尚未充分开发的微生物资源——红树林沉积物这一独特的极端环境微生物库。

尼日利亚卡拉巴尔大学的研究团队从大克瓦河红树林沉积物中分离到一株高产抗菌物质的Lysinibacillus macroides UCCM 00159，其原始发酵效价仅0.2g/L。通过创新的"生物诱导"策略和系统的培养基优化，最终在5L生物反应器中实现187.09g/L的突破性产量。相关研究成果发表在《BMC Biotechnology》上，为解决食品保藏和农业病害防控提供了新思路。

研究采用响应面法(RSM)进行多阶段优化：首先通过单因素实验筛选碳源（大米加工废水RPE）、氮源（酪蛋白氨基酸CAA）等基础组分；继而采用Plackett-Burman设计从11个因素中筛选出6个关键变量；最后通过中心复合设计建立预测模型。生物诱导实验采用细菌-霉菌共培养系统，通过HPLC和Tricine-SDS-PAGE鉴定活性成分。抗菌活性通过EUCAST标准方法评估，抗氧化能力采用DPPH、ABTS^•+和FRAP三种方法测定。

【菌株分离与鉴定】
采用拥挤平板法从红树林沉积物中分离到11株抗菌活性菌，其中菌株A9（后鉴定为Lysinibacillus macroides）对敏感霉菌Aspergillus austroafricanus UCCM 00160的抑菌圈直径(ZND)达17mm。16S rRNA测序显示该菌与L. macroides strain PF29X相似度>99%，其细胞壁含有典型的A4α型肽聚糖(Lys-Asp型)。

【培养基优化】
单因素实验发现大米加工废水(RPE)作为碳源时抑菌活性提高1.33倍，酪蛋白氨基酸(CAA)使活性提升1.67倍。Plackett-Burman设计筛选出6个关键因素，建立的一阶模型预测精度达94.69%。最终优化培养基包含：44.84%(v/v)RPE、8.58g/L CAA、1.39g/L MgSO₄•7H₂O、2.78g/L CaCl₂•2H₂O、16.94%(v/v)接种量和10.45g/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，使细菌素产量达9.6g/L。

【生物诱导增产】
共培养实验揭示4:6的菌-霉比例实现最大22.2g/L产量，较单菌培养提高13.69倍。5L发酵罐放大后产量飙升至187.09g/L，较摇瓶水平又提高8.11倍。这表明敏感霉菌分泌的次级代谢物可能激活了细菌的沉默生物合成基因簇(BGCs)。

【活性物质鉴定】
硅胶色谱分离获得9个生物活性组分，其中保留时间9.02min的Fraction C活性最强(ZND=38.1±1.7mm)。Tricine-SDS-PAGE确定其分子量为10.5kDa，氨基酸分析显示富含Gly(18.6%)、Cys(16.5%)和Phe(13.4%)。经ExPASy ProtParam工具预测，该"macroidin"具有碱性等电点(pI=8.52)和良好水溶性(GRAVY=-0.097)，但体外稳定性较差(不稳定性指数45.38)。

【功能特性评估】
温度稳定性实验显示90°C处理保留91.25%活性，但121°C完全失活。pH稳定性测试表明在3-10范围内保持活性，最适pH偏碱性。酶敏感性实验证实其抗菌活性主要依赖肽链结构（对蛋白酶敏感），脂质组分也起辅助作用（对脂肪酶部分敏感）。抗菌谱分析显示对革兰阳性菌活性显著，尤其对Listeria monocytogenes ATCC 23074的MIC仅0.98μg/mL，对植物病原菌Erwinia carotovora ATCC 39048的MIC为7.8μg/mL。抗氧化实验显示其DPPH清除能力(89.67%)与抗坏血酸相当(92.05%)，FRAP值达74.18mM FeSO₄当量。

【应用潜力验证】
在混合果汁保鲜实验中，31.3μg/mL的macroidin可使L. monocytogenes在4°C下120天保持零检出，效果优于商品化nisin。对Aspergillus flavus ATCC 21882的抑制活性(MIC=1.95μg/mL)表明其在防控粮食霉变方面具应用前景。

该研究首次报道了Lysinibacillus属产生异环蒽素样细菌素的现象，通过创新的生物诱导策略实现了48.7倍的产量提升。macroidin兼具抗菌和抗氧化双重功能，其广谱活性（尤其对食源性致病菌和植物病原菌）和食品级安全性（可被消化道蛋白酶降解）使其成为理想的生物防腐剂候选。研究建立的"共培养-RSM"协同优化策略为微生物次级代谢产物的增产提供了普适性方法学参考。未来研究可进一步解析生物诱导的分子机制，并通过基因工程改造提升产物稳定性。这项来自尼日利亚本土微生物资源的研究成果，不仅为应对全球抗生素耐药性挑战提供了新武器，也展示了发展中国家在生物技术领域的创新潜力。