真菌质膜H+-ATP酶六聚体组装与协同机制：N端延伸域介导的跨亚基协作及其药物开发潜力

本研究解析了真菌质膜H+-ATP酶（Pma1）通过N端延伸域（NTE）介导六聚体协同活性的分子机制。首次发现NTE以域交换形式连接相邻亚基的核苷酸结合域（N-domain）与驱动域（A-domain），实现ATP酶活性的正协同效应（Hill系数=2.28），为靶向Pma1的抗真菌药物设计奠定结构基础。

　　

真菌质膜H⁺-ATP酶的六聚体协同机制

Highlights
• 真菌质膜H⁺-ATP酶（Pma1）以六聚体形式发挥协同功能
• 域交换的N端延伸域（NTE）介导Pma1亚基间协作
• NTE成为调控生理功能及药物开发的潜在靶点

Summary
作为维持真菌细胞内pH和膜电位的关键质子泵，Pma1是P型ATP酶家族中唯一形成六聚体的成员。本研究揭示其六聚体通过NTE实现ATP酶活性的协同效应——单个亚基的NTE结合相邻亚基的N-domain，将构象变化传递至整个六聚体，显著提升质子泵效率。这一发现为理解Pma1快速响应环境变化的生理机制及抗真菌药物开发提供新视角。

The Pma1 hexamer functions cooperatively in ATP hydrolysis
通过构建单体化突变体Pma1-2mut（R898L/E901L），研究发现六聚体ATP水解活性显著高于单体（Hill系数2.28 vs 0.81）。模拟磷酸化激活的S911E/T912E突变体仍保持协同性，证实C端自抑制区释放后NTE仍介导协作。冷冻电镜结构显示，激活态Pma1（E2P状态）中NTE形成短螺旋（H1-H3），其中H1以域交换形式锚定相邻亚基N-domain的碱性残基簇（如414-RKKK-417），通过静电和疏水作用实现亚基耦合。

Cryo-EM structure of activated Pma1 reveals a domain-swapped NTE
3.4?分辨率的激活态结构显示，NTE的Glu36-Gly55（H1）像"分子桥梁"连接相邻亚基：其39-DDDD-42酸性基团与N-domain的RKKK基序形成电荷互补，而Ile43/Leu50等疏水残基嵌入N-domain的疏水口袋。局部精修获得三种构象（占比58.3%/19.1%/22.6%），显示六聚体中4-5个亚基的A/N-domain有序排列，暗示协同可能涉及3-4个亚基的同步运动。

Interaction between NTE and the N-domain is essential for Pma1’s function
表面等离子共振（SPR）测定N-domain与NTE肽段（Glu37-Gly55）结合解离常数K_D=105μM，而D44L/E48L/Q51L突变完全破坏相互作用。生长互补实验证实，删除NTE（Δ1-64/Δ1-107）或突变N-domain结合位点（K416L/K424L等）均导致酵母死亡。有趣的是，在NTE连接区插入5/10个氨基酸虽不破坏六聚体组装，但显著削弱功能，表明连接区长度经进化精确优化。

The cooperative activity of Pma1 is mediated by NTE
TEV蛋白酶切割NTE连接区产生的Pma1-ΔN64虽保持六聚体形态，但ATP酶活性协同性完全丧失（Hill系数降至1.0）。这验证了NTE像"分子弹簧"传递构象变化的假说：当某个亚基的A-domain因ATP水解发生位移时，通过NTE拖拽相邻亚基N-domain，实现六聚体"多米诺骨牌"式的协同激活。

NTE also couples the neighboring subunits in the autoinhibited state
自抑制态结构中，NTE-H1被"夹"在相邻亚基的N/A-domain之间：除保留与N-domain的相互作用外，其Ser52/Asn53还与A-domain的Gln224/Asp238形成氢键网络。点突变（Q224L/D238L等）破坏这种三方接触会导致功能缺陷，说明NTE在自抑制和激活态均扮演机械耦合器的角色。

讨论与展望
该研究提出全新协作模型：六聚体通过NTE串联实现"三明治式"构象传递——ATP结合触发一个亚基N-domain位移，经NTE牵引相邻A-domain旋转60°，最终驱动TMH1-2运动完成质子转运。序列分析显示，NTE介导的协作机制在念珠菌等致病真菌中保守，但在曲霉中可能变异。研究者推测，六聚体架构使真菌在葡萄糖充足时（ATP>3mM）能高效泵出糖酵解产生的质子，这种"代谢感应"特性使其成为广谱抗真菌药的理想靶点。

局限性
当前研究未直接测定质子转运的协同性，且植物PM H⁺-ATPase通过14-3-3蛋白而非NTE实现六聚化，提示不同物种可能存在替代机制。未来需开发特异性抑制NTE相互作用的小分子，以验证其治疗侵袭性真菌感染的潜力。