基因工程化纳米平台递送免疫治疗配体PD-L1和Gal-9缓解原发性卵巢功能不全的机制研究

本研究针对原发性卵巢功能不全(POI)中T细胞异常激活导致的卵巢功能衰退问题，通过基因工程改造HEK-293T细胞来源的细胞外囊泡(EVs)，构建了同时呈现免疫检查点配体PD-L1和Gal-9的纳米平台。该平台能特异性诱导过度活化的PD-1+CD8+T细胞凋亡，显著降低卵巢内细胞毒性T细胞浸润，恢复血清抗苗勒管激素(AMH)水平，为POI的免疫调节治疗提供了新策略。研究成果发表于《Cell Communication and Signaling》。

　　

卵巢是女性生殖系统的核心器官，其功能衰退会引发不孕、骨质疏松等一系列健康问题。原发性卵巢功能不全(Primary Ovarian Insufficiency, POI)指女性40岁前出现的卵巢功能衰竭，目前临床主要采用激素替代疗法，但无法从根本上解决免疫系统攻击卵巢组织这一关键病理机制。越来越多的证据表明，POI患者卵巢中存在大量浸润的CD8⁺T细胞，这些过度活化的免疫细胞通过分泌穿孔素(perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)等细胞毒性物质破坏卵泡。如何精准调控这些"失控"的免疫细胞，成为治疗POI的新思路。

复旦大学附属妇产科医院的研究团队独辟蹊径，将癌症免疫治疗中常用的PD-1/PD-L1通路"反向"应用于自身免疫性疾病治疗。他们创新性地设计了一种基因工程化细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)，通过同时展示两种免疫抑制分子PD-L1和Galectin-9(Gal-9)，实现对过度活化T细胞的双重打击。这种"智能"纳米平台不仅能靶向结合PD-1⁺和TIM-3⁺T细胞，还能显著降低这些细胞的毒性功能，在动物模型中成功逆转了卵巢萎缩和激素紊乱。该成果为POI的病因治疗提供了全新视角，相关论文发表在《Cell Communication and Signaling》上。

研究团队首先通过比较CD63、CD81、CD9和Lamp2b四种支架蛋白的装载效率，确定Lamp2b是最佳选择。采用"all in one"质粒策略，将PD-L1和Gal-9基因通过P2A序列串联表达，显著提高了EVs的结合能力。从POI患者和动物模型中分离的免疫细胞分析显示，工程化EVs能特异性诱导PD-1⁺CD8⁺T细胞凋亡。通过纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)确认EVs的物理特性，并利用流式细胞术和ELISA评估其免疫调节效果。

Dysregulated T cells distribution in POI
临床样本分析发现POI患者外周血和卵巢组织中PD-1⁺CD8⁺T细胞比例显著升高，而调节性T细胞(Treg)减少，证实免疫失衡是POI的重要特征。

Identification of diverse EVs for presenting molecules
Lamp2b支架的EVs在HiBiT蛋白标记系统中表现最优，其装载效率是其他支架蛋白的2-3倍，且能更有效地被外周血单个核细胞(PBMCs)摄取。

The binding ability of PD-L1-Gal-9 EVs
"all in one"质粒策略构建的PD-L1-Gal-9 EVs展现出更强的T细胞结合能力，双荧光标记证实其可同时递送两种免疫调节分子。

The biological behavior of PD-L1-Gal-9 EVs
体外实验显示，工程化EVs能显著促进PD-1⁺T细胞凋亡，并将活化T细胞中Foxp3⁺Treg比例降低60%。

Therapeutic efficacy in POI mice
在pZP3诱导的POI小鼠模型中，EVs治疗使卵巢重量恢复近正常水平，AMH和E₂水平显著提升，各级卵泡数量增加2-3倍。

Suppression of over-activated T cells
免疫荧光显示EVs治疗组卵巢PD-1⁺和TIM-3⁺细胞浸润减少，流式检测证实perform⁺和Granzyme A⁺CD8⁺T细胞比例下降50%。

Biodistribution evaluation
纳米荧光素酶(NanoLuc)标记显示EVs主要在给药后3天内发挥作用，7天后基本被清除，未观察到长期免疫抑制。

这项研究开创性地将免疫检查点调节策略应用于生殖内分泌领域，解决了传统疗法无法针对POI免疫病因的难题。通过基因工程改造的EVs纳米平台，实现了对病理T细胞的特异性调控，避免了全身免疫抑制的副作用。特别是"all in one"的质粒设计策略，为多靶点EVs的构建提供了新思路。研究不仅证实了PD-L1/Gal-9双靶点协同作用的优越性，还建立了可推广的POI免疫治疗评价体系。尽管EVs的体内持久性有待优化，但这项工作为开发"卵巢免疫微环境调节剂"奠定了坚实基础，对保护女性生殖健康具有重要临床意义。