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为探究 RUNX2 如何调控颅底软骨结合（synchondroses）软骨细胞，研究人员利用 Fgfr3-creER 小鼠模型敲除 Runx2，发现其导致颅底前后生长受限、软骨结合早熟骨化，且 FGFR3 及 pERK1/2、SOX9 信号升高。该研究揭示 RUNX2-FGFR3-MAPK-SOX9 轴，为相关疾病提供新靶点。
在颅面发育的神秘版图中，颅底软骨结合作为关键的生长枢纽，如同精密运转的生物引擎，驱动着颅底的前后向生长。这些由双向软骨细胞层构成的特殊结构，不仅是骨骼生长的核心，其异常更与多种严重的颅面畸形紧密相连。例如，RUNX2 单倍不足引发的 Cleidocranial dysplasia（CCD，锁骨颅骨发育不良）患者，常伴随中面部生长不足的困境，而 FGFR3 激活突变导致的软骨发育不全（achondroplasia），则会引发颅底软骨结合的早熟融合，如同齿轮过早生锈卡死，严重阻碍生长。然而，RUNX2 这位 “分子指挥官” 究竟如何在颅底软骨结合中调控软骨细胞的命运，长期以来如同被迷雾笼罩，困扰着研究者们。解开这一谜团，不仅能揭示颅面生长的深层机制，更为这些致残性疾病的治疗打开新的窗口。
为了驱散这层迷雾，美国密歇根大学牙学院、德克萨斯大学健康科学中心等机构的研究人员携手展开探索。他们以小鼠为研究对象，利用 tamoxifen 诱导的 Fgfr3-creER 小鼠模型，在出生后的颅底软骨结合软骨细胞中特异性敲除 Runx2，构建了 Fgfr3-Runx2cKO小鼠模型，如同为细胞装上了精准的 “基因开关”，开启了对 RUNX2 功能的深度解析之旅。这项研究的成果发表在《Bone Research》上，为颅底发育机制的研究添上了浓墨重彩的一笔。
研究者们运用了多种关键技术来揭开 RUNX2 的神秘面纱。通过 3D 微计算机断层扫描（3D-μCT），他们如同拥有了 “电子显微镜般的眼睛”，精确测量小鼠颅骨的生长变化，捕捉到颅底前后向生长的细微差异；免疫组织化学（IHC）和免疫荧光技术则如同一台 “分子摄像机”，清晰展现 RUNX2、FGFR3、磷酸化 ERK1/2（pERK1/2）等蛋白的分布与表达变化；荧光 RNA 原位杂交（RNAscope）技术则像一本 “基因字典”，解读 Fgfr3 和 Rankl 等基因的转录奥秘；EdU 标记实验如同 “细胞增殖的计时器”，揭示软骨细胞的增殖活性；而细胞凋亡检测（如 cleaved Caspase 3 染色）则如同 “细胞生死的判官”，记录下软骨细胞的凋亡轨迹。此外， lineage tracing（谱系追踪）技术如同 “细胞的 GPS 定位系统”，追踪 Fgfr3+细胞向成骨细胞的分化路径，为研究提供了多维度的证据支持。
Fgfr3-creER 标记颅底软骨结合的软骨细胞及其前体
研究发现，Fgfr3-creER 在出生后的颅底软骨结合中能够高效标记软骨细胞及其前体。通过与 R26RtdTomato和 Col1a1 (2.3 kb)-GFP 报告线杂交，研究者观察到，在 tamoxifen 诱导后，Fgfr3+细胞在不同时间点逐渐分化为成骨细胞，尤其是在出生后早期（如 P10、P21），这种分化现象更为明显。随着时间推移，到 P42 及成年阶段（3 个月、8 个月），Fgfr3+细胞依然在软骨结合及其周围骨区域中存在，表明其在维持软骨结合结构和功能中具有长期作用。这一结果不仅验证了 Fgfr3-creER 模型在研究颅底软骨结合中的有效性，也为后续研究奠定了基础。
Runx2 失活导致颅面骨骼异常
Fgfr3-Runx2cKO小鼠表现出明显的骨骼侏儒症，体重、鼻肛长度和尾长均显著减少。3D-μCT 分析显示，其颅底前后向生长严重受阻，与对照组相比，P9 到 P42 期间颅骨长度几乎没有增长，而对照组增长约 20%。同时，颅穹窿和面部长度减少，颅穹窿宽度增加，呈现出类似综合征性颅缝早闭的 “穹顶状” 颅骨。组织学分析发现，颅底软骨结合（如 SOS、ISS）出现早熟骨化，软骨细胞层结构紊乱，肥大样软骨细胞大量出现，中央区域形成 “骨桥”，表明 RUNX2 缺失导致软骨结合的正常发育进程被打破，过早走向骨化阶段。
Runx2 失活破坏软骨结合的细胞组织
Safranin-O 和 H&E 染色显示，对照组小鼠的软骨结合具有清晰的静止区、增殖区、前肥大区和肥大区，细胞排列有序。而 Fgfr3-Runx2cKO小鼠的软骨结合组织架构严重紊乱，异常的球状肥大样软骨细胞占据主导，软骨基质降解明显，中央区域出现早熟融合。免疫组化检测磷酸化 RUNX2（pRUNX2）显示，在对照组的增殖区可见 pRUNX2+细胞，而在突变体中几乎消失，证实了 Runx2 的有效失活。这表明 RUNX2 对于维持软骨结合软骨细胞的正常组织和分化至关重要。
Runx2 失活损害成骨细胞分化
通过 Col1a1-GFP 和 Rosa26-tdTomato 谱系追踪，研究者发现，Fgfr3-Runx2cKO小鼠的小梁骨形成减少，Col1a1-GFP+成骨细胞数量显著降低，尤其是在出生后早期（P10、P21、P42）。在 3 个月时，虽然 “骨桥” 区域有 Col1a1-GFP+成骨细胞存在，但这些细胞 tdTomato 阴性，表明它们并非来源于 Fgfr3+细胞，而是来自其他未知细胞来源。这说明 RUNX2 缺失不仅影响 Fgfr3+软骨细胞向成骨细胞的分化，还可能干扰其他成骨细胞来源的分化过程，导致骨形成异常。
Runx2 失活抑制增殖并促进凋亡
EdU 标记实验显示，对照组的增殖区可见大量 EdU+Fgfr3CE-tdT+细胞，而 Fgfr3-Runx2cKO小鼠的软骨结合中 EdU+细胞几乎消失，表明 RUNX2 缺失显著抑制软骨细胞的增殖。同时，cleaved Caspase 3 染色显示，突变体中凋亡细胞数量大幅增加，且随机分布于整个软骨结合，而对照组仅在肥大区邻近初级海绵骨处有少量凋亡细胞。这说明 RUNX2 在维持软骨细胞的增殖活性和抑制凋亡中起着关键作用，其缺失导致细胞增殖与凋亡的平衡被打破，加速软骨结合的退化。
Runx2 失活导致软骨细胞早熟肥大
免疫组化检测 I 型胶原（COLX）发现，对照组的 COLX+细胞局限于肥大区和中央区，而 Fgfr3-Runx2cKO小鼠的软骨结合中 COLX+细胞大量增加，且随机分布于整个软骨层，尤其是在出生后早期（P10、P21）。RNAscope 检测显示，Rankl mRNA 表达显著升高，广泛分布于突变体的软骨结合中。这表明 RUNX2 缺失导致软骨细胞过早进入肥大阶段，并通过升高 Rankl 表达刺激破骨细胞生成，进而引发软骨基质的降解和骨化提前。
破骨细胞驱动 Fgfr3-Runx2cKO软骨结合的降解
TRAP 染色显示，Fgfr3-Runx2cKO小鼠的 SOS 和 ISS 区域有大量 TRAP+破骨细胞聚集，尤其是在早熟骨化的中央区域。荧光 TRAP 染色（ELF97）进一步证实，破骨细胞与 Fgfr3CE-tdT+软骨细胞和 Col1a1-GFP+成骨细胞相邻，表明破骨细胞介导的软骨降解是导致软骨结合早熟融合的重要因素。此外，CD31 和 VEGFR 免疫染色显示，突变体中血管生成减少，可能与软骨细胞肥大和骨化异常相关，进一步影响软骨结合的正常发育。
RUNX2-FGFR3-MAPK-SOX9 信号调控颅底发育
研究发现，Fgfr3-Runx2cKO小鼠的软骨结合中 Fgfr3 mRNA 和 FGFR3 蛋白表达显著升高，FGFR3 蛋白主要定位于细胞核，类似于 FGFR3 激活突变（如 G380R）的分布模式。下游信号分子 pERK1/2 的表达也增加，且随机分布于软骨细胞中，表明 FGFR3-MAPK 信号通路被激活。同时，SOX9 蛋白的荧光强度在突变体中升高，而 SOX9 是 FGFR3 下游的关键转录因子，参与软骨细胞的分化调控。这些结果表明，RUNX2 可能通过负调控 FGFR3，抑制其下游 MAPK-SOX9 信号通路，从而维持软骨结合的正常发育。RUNX2 缺失导致 FGFR3 信号过度激活，驱动软骨细胞早熟肥大和凋亡，最终引发颅底生长异常。
这项研究如同在黑暗的迷宫中点燃了一盏明灯，首次揭示了 RUNX2 在颅底软骨结合发育中的关键作用，描绘出 RUNX2-FGFR3-MAPK-SOX9 信号轴调控颅底生长的分子蓝图。它不仅为 Cleidocranial dysplasia 和软骨发育不全等疾病的发病机制提供了新的解释，更如同为治疗打开了一扇希望之窗 —— 靶向 FGFR3-MAPK 信号通路可能成为干预颅底生长异常的新策略。然而，如同所有科学探索一样，这项研究也留下了一些待解之谜，例如不同软骨结合（如 SOS、ISS、AIOS）对 RUNX2 缺失的反应差异，以及非 Fgfr3+来源成骨细胞的具体起源和调控机制。但毫无疑问，这项研究为颅面发育和相关疾病的研究奠定了坚实的基础，引领着研究者们朝着更深入的科学领域继续探索前行。
