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为探究胰岛素通过磷酸化丙酮酸脱氢酶 E1α 亚基（PDHA1Ser293）促进 HepG2 细胞增殖的机制，研究人员开展 eEF-1γ 与 p-PDHA1 相互作用研究。发现 eEF-1γ 形成三聚体复合物，调控组蛋白乙酰化及 RBP4 表达，抑制 eEF-1γ 可抑制肿瘤进展，为肝癌治疗提供新靶点。
在肝脏疾病的研究领域，肝细胞癌（HCC）作为一种恶性肿瘤，其发病机制复杂，严重威胁人类健康。胰岛素在正常肝脏组织和肝癌细胞中的作用存在显著差异，在正常肝细胞中胰岛素诱导 PDHA1 去磷酸化，而在 HepG2 肝癌细胞中却使 PDHA1 在 Ser293 位点磷酸化，这种差异与 Warburg 效应相关，但其背后的具体分子机制尚不清楚。为了揭示这一机制，深入了解胰岛素如何驱动肝癌细胞增殖，来自韩国翰林大学医学院（Hallym University College of Medicine）的研究人员开展了相关研究。该研究发现了 eEF-1γ 在其中的关键作用，为肝细胞癌的治疗提供了新的思路和潜在靶点，研究成果发表在《Communications Biology》上。
研究人员为开展研究，主要运用了以下关键技术方法：通过免疫共沉淀（Co-IP）技术验证蛋白质之间的相互作用，如 eEF-1γ 与 p-PDHA1、PKM2 的结合；利用染色质免疫沉淀 PCR（ChIP-PCR）技术证实 eEF-1γ 与 RBP4 启动子的关联；采用 siRNA 干扰技术沉默 eEF-1γ、PDHA1、PKM2、RBP4 等基因，观察相关蛋白表达和细胞功能的变化；运用 CCK-8 assay 检测细胞增殖能力，通过伤口愈合实验和 Trans-well 侵袭实验分析细胞迁移和侵袭能力；构建 4T1 xenografts 模型进行体内实验，研究 eEF-1γ knockdown 对肿瘤生长的影响；此外，还利用 Western blot 分析蛋白表达水平，通过实时定量 PCR（RT-qPCR）检测 mRNA 水平。研究中使用的细胞系包括 HepG2、Huh7、4T1 等，部分实验涉及正常大鼠肝组织和原代肝细胞样本。
结果总结
p-Ser293 PDHA1 与 eEF-1γ 结合
研究人员通过制备重组 GST-PDHA1 S293D 突变体作为诱饵，利用 MALDI-TOF 分析捕获的结合蛋白，发现 eEF-1γ 与 PDHA1 S293D 结合。体外实验显示，eEF-1γ 与 GST-PDHA1 S293D 结合，而不与野生型（WT）或去磷酸化模拟形式（S293A）结合。在 HepG2 和 Huh7 细胞中，通过免疫共沉淀证实 p-Ser293 PDHA1 与 eEF-1γ 相互作用，非磷酸化 PDHA1 与 eEF-1γ 的共沉淀极少。免疫荧光实验表明，胰岛素处理后 eEF-1γ 从细胞质转移至细胞核。此外，eEF-1γ 在多种癌细胞系中表达较高，胰岛素处理可上调其表达。
胰岛素诱导 eEF-1γ/p-Ser293 PDHA1/PKM2 三聚体复合物形成
免疫共沉淀实验显示，eEF-1γ 与 p-PDHA1、PKM2 结合，与非磷酸化 PDHA1、PDHE2、PDHE3 亚基结合极少，PKM2 也与 eEF-1γ 和 p-PDHA1 结合。si-eEF-1γ 转染导致 p-PDHA1 和 PKM2 水平下调，复合物形成减少，表明 eEF-1γ 维持二者稳定性。体外实验表明，eEF-1γ 在无胰岛素时结合 PKM2 的 C 末端结构域（CTD），胰岛素刺激后结合 A2 结构域和 CTD；p-PDHA1 与 eEF-1γ 的 CTD 结合，PKM2 主要与 N 末端结构域（NT）结合。通过 BS3 交联试剂观察到约 140 kDa 和 200 kDa 的蛋白条带，推测形成三聚体复合物。PDHA1 S293D 突变体可与 eEF-1γ 和 PKM2 共沉淀，而 S293A 突变体则不能，说明 PDHA1 Ser293 磷酸化对复合物形成至关重要。PKM2 乙酰化模拟突变体（K305Q）减弱与 p-PDHA1 和 eEF-1γ 的结合，而去乙酰化模拟突变体（K305R）无影响，且 p-Tyr105 PKM2 不参与复合物形成。此外，LPS 刺激在 4T1 细胞中也能促进 PKM2 与 p-PDHA1、eEF-1γ 的共沉淀，提示复合物形成可能不限于 HepG2 / 胰岛素场景。
eEF-1γ 参与细胞核内组蛋白乙酰化
胰岛素处理促进 H3 和 H4 乙酰化及 ACL 表达。p-Tyr42 RhoA 与 PKM2、ACL 结合，但不与 p-PDHA1、eEF-1γ 结合，胰岛素促进 ACL 与 PKM2、eEF-1γ、p-Tyr42 RhoA 共沉淀，也增加 p300 乙酰转移酶与 p-PDHA1、PKM2、eEF-1γ 的共沉淀。si-eEF-1γ 显著降低 Ac-H3K27 水平，对 Ac-H3K9/14 和 Ac-H3K18 影响较小，si-ACL 则显著消除 H3K9/14、H3K18、H3K27 的乙酰化，表明 ACL 为组蛋白乙酰化提供乙酰 - CoA。eEF-1γ 还与 STAT3、Oct4 等转录因子共沉淀，提示复合物参与特定基因的转录调控。
eEF-1γ 调控视黄酸结合蛋白 4（RBP4）的表达
胰岛素处理以时间依赖方式增加 HepG2 和 Huh7 细胞中 RBP4 的蛋白和 mRNA 水平。si-eEF-1γ 抑制 RBP4 表达，eEF-1γ WT 重构可恢复其表达，si-PDHA1 和 si-PKM2 也消除 RBP4 表达，表明三聚体复合物对 RBP4 表达必要。PDHA1 WT 和 S293D 突变体可挽救 si-PDHA1 转染细胞的 RBP4 表达，而 S293A 不能，说明 PDHA1 Ser293 磷酸化对 RBP4 表达关键。ChIP-PCR 证实 p-PDHA1、PKM2、eEF-1γ 与 RBP4 启动子结合，预测 PDHA1 可能是主要的 DNA 结合成分。胰岛素促进 RBP4 启动子区域 H3K27、H3K18、H3K9/14 的乙酰化，si-RBP4 转染增加葡萄糖消耗，提示 RBP4 抑制 HepG2 细胞的葡萄糖利用。
eEF-1γ 调控细胞增殖、迁移和侵袭
si-eEF-1γ 抑制 HepG2、Huh7、Hepa1c1c7 细胞增殖，降低 c-Myc 和 cyclin D1 蛋白水平，eEF-1γ WT 重构可恢复。伤口愈合实验显示 si-eEF-1γ 减少 HepG2 细胞迁移，下调上皮 - 间质转化（EMT）标志物 ZEB1、N-cadherin、vimentin、Snail1，上调 E-cadherin。ChIP-PCR 显示 eEF-1γ 与 ZEB1 启动子结合，调控其表达。胰岛素降低 E-Cadherin-Luc 活性，si-eEF-1γ 上调其活性，eEF-1γ WT 重构再次降低，表明 eEF-1γ 对胰岛素诱导的 EMT 过程至关重要。外源性 RBP4 抗体或 si-RBP4 转染抑制胰岛素诱导的细胞迁移和侵袭，RBP4 WT 转染恢复迁移能力，且 si-RBP4 降低 p-Tyr42 RhoA、RhoA、ROCK1/2 水平，提示 RBP4 通过 RhoA/ROCK 通路发挥作用。
eEF-1γ 参与肿瘤发生
在 4T1 细胞的异种移植实验中，si-eEF-1γ 抑制肿瘤形成，eEF-1γ WT 重构恢复肿瘤进展。肝癌组织中 eEF-1γ、p-PDHA1、PKM2 水平高于癌旁组织。 Kaplan-Meier 生存分析显示，eEF-1γ 高表达的肝癌患者生存概率显著较低，提示 eEF-1γ 可作为肝癌的预后标志物。
结论与讨论
本研究揭示了在肝细胞癌细胞中，胰岛素诱导 PDHA1Ser293磷酸化，与 eEF-1γ、PKM2 形成三聚体复合物并转移至细胞核。该复合物通过招募 p300 乙酰转移酶和 ACL，调控组蛋白乙酰化，进而促进 RBP4 等基因的表达，驱动细胞增殖、迁移和侵袭。体内外实验表明，抑制 eEF-1γ 可显著抑制肿瘤生长，且 eEF-1γ 高表达与肝癌患者预后不良相关。这些发现不仅阐明了胰岛素在肝癌中的异常信号通路，还首次揭示了 eEF-1γ 在翻译延伸功能之外，作为核内信号枢纽的新角色，为肝细胞癌的治疗提供了潜在靶点 eEF-1γ，有望开发针对该分子的新型抗癌疗法。同时，研究还提示 RBP4 及相关通路在肝癌进展中的重要性，为进一步探索肝癌的代谢重编程和表观遗传调控机制奠定了基础。
