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为探究真核细胞 tRNA 折叠及相互作用对应激的响应机制，研究人员开发 DM-DMS-MaPseq 技术，对人染色体和线粒体 tRNA 结构与相互作用进行分析。发现 tRNA 体内结构稳定但与体外差异大，应激下结构和相互作用改变，为翻译调控研究提供新视角。
在生命科学领域，转运 RNA（tRNA）作为细胞中拷贝数最丰富的 RNA 家族，不仅折叠成特定结构，还参与由氨酰 - tRNA 合成酶、翻译因子和核糖体等构成的复杂细胞相互作用网络。然而，真核细胞中 tRNA 的折叠和相互作用如何响应应激却知之甚少。现有的体外研究虽通过 X 射线晶体学、核磁共振等技术解析了许多 RNA 结构，但体内环境中，RNA 与代谢物、蛋白质、其他核酸的相互作用以及能量依赖的解旋过程等，使得其结构与体外差异显著。因此，深入了解体内 tRNA 的结构动态及应激响应机制，对于揭示其在翻译调控中的功能至关重要。
为解决这一问题，美国芝加哥大学的研究人员开展了相关研究。他们开发了 DM-DMS-MaPseq 技术，该技术利用体内硫酸二甲酯（DMS）化学探针和突变谱分析（MaP），并结合去甲基化酶（DM）处理进行全转录组范围的 tRNA 测序，以分析人类染色体和线粒体编码的 tRNA 的结构和细胞相互作用。研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：体内 DMS 化学探针技术，用于检测 RNA 核苷酸的反应性以评估结构可及性；结合突变谱分析和去甲基化酶处理的 tRNA 测序技术（MSR-seq），以高效准确地对高度结构化和修饰的 tRNA 进行测序分析。
DM-DMS-MaPseq 技术开发
通过在活细胞和体外对 RNA 进行 DMS 处理，结合去甲基化酶去除天然修饰，减少背景突变率，验证了该技术对高度结构化 RNA 的体外和体内评估的可行性。以 5S rRNA 和 tRNAMet为例，体内 DMS 信号显著低于体外，表明体内 tRNA 受蛋白质和核糖体保护，该技术能有效反映 RNA 的结构和相互作用。
染色体编码 tRNA 的体内结构组
人类染色体编码超 600 个 tRNA 基因，其中 429 个高置信度 tRNA 在体内折叠成经典的 “三叶草” 二级结构和 “L 形” 三级结构。同一反密码子家族中不同同功解码 tRNA 的序列差异会影响结构稳定性，高 tRNAScan 评分的同功解码 tRNA 结构更稳定。此外，tRNA 与氨酰 - tRNA 合成酶、EF1A 和核糖体的相互作用可通过体内外 DMS 信号差异推断，如 EF1A 与 tRNA 的 3’CCA 区域结合，核糖体与 tRNA 的 D 环和 T 环相互作用。
氧化应激诱导的胞质 tRNA 结构组和相互作用组变化
用亚砷酸盐处理细胞诱导氧化应激，发现起始 tRNAMet的反密码子环和 D 环 DMS 信号增加，表明其与核糖体相互作用减少。不同 tRNA 因 37 位修饰状态不同对胁迫响应各异，无修饰的 A37 tRNA 信号增加，修饰的 tRNA 信号变化小或降低。 polysome 分析显示，应激下翻译使用减少的 tRNA 反密码子环和 3’CCA 的 DMS 信号更高。
线粒体 tRNA 的体内结构映射
人类线粒体有 22 种 tRNA，其 A/U 丰富序列和非经典三级相互作用使体外结构稳定性低，但体内因与线粒体蛋白和核糖体相互作用结构得以稳定。不同类型的线粒体 tRNA 在体内外结构差异显著，如 III 型 mt-tRNASer(GCU) 体内结构更稳定。此外，线粒体 tRNA 与 EF-Tu 的相互作用也遵循与原核类似的平衡原则。
亚砷酸盐胁迫诱导的 mt-tRNA 结构变化
亚砷酸盐胁迫下，线粒体翻译减少，mt-tRNAMet反密码子环 DMS 信号增加，且所有 mt-tRNA 结构均发生显著改变。polysome 富集的 mt-tRNA 在胁迫下 DMS 反应性更高，提示线粒体和胞质翻译系统在 tRNA - 核糖体相互作用响应胁迫的模式不同。
该研究通过 DM-DMS-MaPseq 技术，首次全面揭示了人类胞质和线粒体 tRNA 在体内的结构组和动态相互作用组，发现 tRNA 在体内结构稳定但与体外差异显著，且在应激下结构和相互作用发生动态变化，这些变化与翻译调控功能密切相关。研究结果为理解 tRNA 在翻译调控和应激响应中的作用提供了新机制，也为 RNA 结构和相互作用研究提供了重要的方法学参考，有助于深入探索相关疾病中 tRNA 的功能异常。
