基于生物信息学的布鲁氏菌多表位融合蛋白制备及其在人布鲁氏菌病血清学诊断中的应用

为解决布鲁氏菌病诊断中传统抗原（如LPS和Rose Bengal抗原）存在的交叉反应性问题，研究人员通过生物信息学方法预测布鲁氏菌5种抗原蛋白（Erythritol kinase、NDK等）的B细胞线性表位，构建多表位融合蛋白，并建立间接ELISA（iELISA）检测体系。结果显示，该融合蛋白灵敏度为0.8095，特异性达0.9949，显著降低与其他病原体的交叉反应，为高特异性诊断抗原开发奠定基础。

　　

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的人畜共患病，全球畜牧业发展和国际贸易加速使其发病率持续上升。患者临床表现为发热、关节痛等非特异性症状，易与其他疾病混淆。目前诊断主要依赖血清学检测（如SAT和iELISA）、细菌培养及分子生物学技术，但传统抗原如脂多糖（LPS）和Rose Bengal抗原存在与耶尔森菌O9、大肠杆菌O157:H7等交叉反应的局限性，亟需开发高特异性诊断工具。

上海交通大学医学院附属第九人民医院与徐州医科大学的研究团队通过生物信息学预测布鲁氏菌5种关键抗原蛋白（Erythritol kinase、NDK、Adenosylhomocysteinase、BCSP31和Lyso-ornithine lipid O-acyltransferase）的B细胞线性表位，利用ABCpred、SVMTriP等4种工具筛选出28个候选表位，通过“GGGS”连接子构建多表位融合蛋白（402个氨基酸，37.5 kDa）。该蛋白经原核表达纯化后，用于iELISA检测189例阳性及196例阴性人血清样本，结合分子对接（ZDOCK 3.0.2）和分子动力学模拟（GROMACS）评估其结合特性，成果发表于《Scientific Reports》。

关键方法

1. 表位预测：联合4种生物信息学工具筛选重叠表位；
2. 蛋白构建：表位串联后克隆至pET30a载体，于BL21大肠杆菌中表达；
3. 血清检测：iELISA分析灵敏度/特异性，ROC曲线评估诊断效能；
4. 计算模拟：通过I-TASSER预测三维结构，分子动力学模拟分析结合稳定性。

研究结果
Prediction of B-Cell epitopes
从5种蛋白中预测出28个表位，如Erythritol kinase的“NTYVTGDHGA”（40-49位）和BCSP31的“DIKAEHLKPGPAGERLKD”（176-193位），长度7-18个氨基酸不等。

Construction and evaluation of fusion protein
融合蛋白pI为5.18，抗原性评分（VaxiJen）1.622，溶解度预测提示可能形成包涵体。三维结构显示表位空间分布合理（图1B）。

Molecular Docking and molecular dynamics simulation
分子对接显示融合蛋白（FP0）与人类IgG Fab（5I19）通过疏水作用（如Tyr103-Leu29）和阳离子-π堆叠（Tyr32-Arg326）结合。100 ns分子动力学模拟证实复合物构象稳定（RMSD<0.3 nm），核心区域波动较低（RMSF<0.15 nm）。

Preparation of fusion protein
SDS-PAGE显示66 kDa目标蛋白纯度>90%（图3），镍柱纯化后可用于iELISA。

Results of IELISA
ROC曲线AUC为0.9537（95% CI: 0.9334-0.9740），灵敏度0.8095，特异性0.9949，虽低于LPS（AUC 0.9999）和Rose Bengal抗原（AUC 0.9965），但交叉反应仅5/40例（大肠杆菌等），显著优于传统抗原（16-18例）。

结论与意义
该研究首次将生物信息学预测与实验验证结合，构建的布鲁氏菌多表位融合蛋白在保持较高诊断效能（灵敏度80.95%）的同时，将交叉反应率从40-45%降至12.5%，为开发新一代血清学诊断试剂提供新策略。局限性包括未纳入耶尔森菌O9血清验证，且表位排列顺序未优化。未来可通过调整连接子设计或引入构象表位进一步提升性能。这一成果不仅推动布鲁氏病精准诊断，也为其他病原体的多表位抗原设计提供范式。