双功能变烯二萜合酶结构揭示真菌二萜生物合成与环化的独特机制

研究人员通过冷冻电镜解析了来自Emericella variecolor的双功能变烯二萜合酶(EvVS)的495-kD六聚体结构，发现其异戊二烯转移酶核心被环化酶三聚体夹层式包围。研究表明GGPP（牻牛儿基牻牛儿基二磷酸）通过分子间而非分子内通道传递至非天然环化酶PaFSCY，揭示了真菌双功能萜类合酶中碳管理的独特机制，为萜类生物合成工程提供了新见解。

　　

萜类化合物是自然界中结构最多样的天然产物，在生态防御、药物开发和工业应用中具有重要作用。然而，真菌中广泛存在的双功能萜类合酶（同时包含异戊二烯转移酶和环化酶结构域）如何协调碳骨架组装与环化反应，一直是领域内的未解之谜。这类酶的巨型复合体结构和动态特性使其难以通过传统X射线晶体学解析，导致对GGPP（geranylgeranyl diphosphate）通道化机制的认识存在争议。

宾夕法尼亚大学的研究团队选择Emericella variecolor的变烯二萜合酶(EvVS)作为模型，通过冷冻电镜技术首次完整解析了这种495-kD巨型酶的三维结构。研究发现其六聚体异戊二烯转移酶核心被两组三聚体环化酶结构域像"系船柱"般夹在中间，形成独特的空间架构。令人意外的是，底物竞争实验表明GGPP并非通过分子内通道传递，而是释放到溶液中后再被捕获。但更惊人的发现是：当加入外源的非天然环化酶PaFSCY时，GGPP会优先通过分子间通道传递给后者，这一现象为理解萜类合酶的底物选择性提供了新视角。

关键技术方法包括：1) 冷冻电镜(cryo-EM)解析EvVS全酶结构（分辨率达2.77 ?）；2) 稳态动力学分析比较全长酶与单独环化酶结构域(EvVSCY)的催化效率；3) 底物竞争实验验证GGPP通道化路径；4) AlphaFold3预测22种代表性双功能萜类合酶的寡聚状态；5) 序列相似性网络分析鉴定动物源同源酶。

【结果部分】
催化活性与稳态动力学：EvVS能以DMAPP和IPP为底物高效合成变烯，单独环化酶结构域保持50%催化效率，且严格依赖Mg²⁺。

底物通道化研究：竞争实验显示EvVS自身无GGPP分子内通道化，但与PaFSCY混合时后者获得5.4倍底物偏好性，提示侧向结合可能促进分子间传递。

冷冻电镜结构解析：六聚体核心分辨率达2.77 ?，发现环化酶通过α螺旋（R129-S150）与异戊二烯转移酶（P712-V725）形成1228 ?²界面，呈现"结构域交换"特征。动态分析显示环化酶以接触螺旋为支点摆动（分辨率从核心向外递减）。

AlphaFold3预测：EvVS（ipTM=0.69）和PaFS（ipTM=0.43）分别代表稳定和瞬态域相互作用的两个极端，与实验观察一致。

序列相似性网络：在淡水轮虫Adineta steineri中发现21个含保守金属结合模体的双功能合酶基因，提示水平基因转移可能。

【结论与意义】
该研究首次完整揭示了双功能萜类合酶的"三明治"式组装模式，挑战了传统的分子内通道化假设。发现环化酶通过动态摆动实现多态结合，而GGPP传递路径取决于环化酶-异戊二烯转移酶的特定空间排布。AlphaFold3预测与实验数据的吻合性表明，这种计算方法可有效预测巨型酶复合体的相互作用模式。在轮虫中发现的双功能合酶扩展了这类酶在动物界的分布认知，为理解水平基因转移在代谢进化中的作用提供了新线索。这些发现不仅深化了对萜类生物合成"分子流水线"的认识，也为设计高效萜类生产体系提供了结构基础。论文发表于《Nature Communications》，被同行评价为"解决了双功能萜类合酶领域长期存在的关键问题"。