三种重组右旋糖酐酶催化形成的寡聚与多聚产物精细结构解析及其合成机制研究

推荐：本研究针对乳酸菌来源右旋糖酐酶(Dextransucrases)催化蔗糖生成右旋糖酐(Dextran)过程中初始产物不明确的问题，系统分析了LaniDSΔN、LreuDSΔN和SSAL4550三种重组酶在不同底物条件下形成的寡糖和多糖产物。通过HPAEC-PAD、HPSEC-RI和endo-dextranase酶解等技术，首次定量揭示了蔗糖和葡萄糖作为受体分子的竞争机制，阐明了erlose等低分子量产物不被聚合的规律，为定制特定端基结构的右旋糖酐提供了理论依据。

　　

在食品工业和生物医学领域，由乳酸菌产生的胞外多糖(EPS)因其结构多样性和功能特性备受关注。其中，以α-1,6糖苷键为主链的右旋糖酐(Dextran)因其水溶性和可修饰性，被广泛用作血浆代用品、药物载体和食品添加剂。虽然已知右旋糖酐酶(EC 2.4.1.5)能催化蔗糖合成右旋糖酐，但关于初始寡糖产物的形成规律、不同受体分子(如葡萄糖vs蔗糖)的竞争机制，以及这些低分子量产物如何被延伸为多聚体等核心问题仍缺乏系统研究。

为解决上述问题，德国研究人员Oliver Müller和Daniel Wefers在《Carbohydrate Research》发表了重要成果。他们选取了三种特性迥异的重组右旋糖酐酶：来自Ligilactobacillus animalis的线性低分子量酶LaniDSΔN、来自Steptococcus salivarius的线性酶SSAL4550，以及来自Limosilactobacillus reuteri的高分支度酶LreuDSΔN。通过对比它们在0.25M/1.5M蔗糖溶液（含/不含1M葡萄糖）中的催化行为，结合多维度分析技术，首次揭示了右旋糖酐合成的分子机制。

关键技术包括：1）采用HPAEC-PAD（高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测）定量分析低分子量产物；2）通过HPSEC-RI（高效尺寸排阻色谱-示差检测）表征右旋糖酐分子量分布；3）创新性结合硼氢化钠还原和endo-dextranase酶解技术，特异性捕获并定量多糖链末端结构。

研究结果方面：
3.1节通过序列比对发现，虽然LaniDSΔN与LreuDSΔN结构域相似度达55.31%，但SSAL4550的C端可变区（葡聚糖结合域）显著更长，这与其较高的分子量调控能力相关。
3.2节揭示所有酶均能产生以蔗糖为受体的erlose（三糖）和leucrose（异麦芽酮糖），但HPAEC-PAD数据显示仅当添加1M葡萄糖时才会大量形成以葡萄糖为受体的kojibiose（α-1,2二糖）和异麦芽寡糖(IMOs)。
3.3节突破性地发现：虽然LreuDSΔN产生高达9.9MDa的超高分子量右旋糖酐且不受底物浓度影响，但LaniDSΔN和SSAL4550的产物分子量对条件敏感——1.5M蔗糖使SSAL4550产物从270kDa降至64kDa，而葡萄糖添加更使所有酶产物分子量降低至12kDa以下。

最关键的发现来自对还原性末端的分析：通过鉴定酶解产物中的6-O-α-glucopyranosyl-glucitol（葡萄糖末端）和theanderose（蔗糖末端），首次证明葡萄糖与蔗糖存在受体竞争。定量数据显示，1.5M蔗糖条件下LaniDSΔN产物含11.6μg/mg的果糖末端，而添加1M葡萄糖后葡萄糖末端占比超过90%。特别值得注意的是，尽管erlose和kojibiose在反应液中浓度较高，但酶解产物中未检出其衍生物，证实它们无法被延伸为多聚体。

这项研究的意义在于：1）阐明了右旋糖酐合成过程中受体选择的分子规律，为定向合成特定端基结构的右旋糖酐提供了理论指导；2）发现底物浓度可精确调控SSAL4550等酶的产物分子量，这对工业级右旋糖酐生产具有重要实践价值；3）建立的还原末端分析技术为其他多糖合成机制研究提供了新范式。该成果不仅深化了对糖苷水解酶家族70(GH70)催化机制的理解，更为设计功能化多糖材料开辟了新途径。