新型杀菌剂抗性标记Boscalid在扁豆壳二孢和鹰嘴豆壳二孢遗传改造中的应用研究

本研究针对扁豆壳二孢(Ascochyta lentis)和鹰嘴豆壳二孢(Ascochyta rabiei)遗传改造中标记系统匮乏的难题，通过靶向突变琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)基因H277L位点，成功开发了基于杀菌剂Boscalid抗性的新型选择标记系统。该研究首次实现了A. lentis的多基因敲除和基因互补实验，为解析病原菌效应蛋白功能及宿主-病原互作机制提供了关键工具。

　　

植物真菌病害是威胁全球粮食安全的重要问题，其中由扁豆壳二孢(Ascochyta lentis)和鹰嘴豆壳二孢(Ascochyta rabiei)引起的壳二孢枯萎病分别对扁豆和鹰嘴豆生产造成严重损失。这些病原菌通过分泌效应蛋白(effector)调控宿主免疫反应，但受限于遗传操作工具的匮乏，尤其是A. lentis仅有一种抗生素标记可用，严重阻碍了对其致病机制的深入研究。

澳大利亚谷物研究与开发组织(GRDC)和科廷大学作物病害管理中心(CCDM)的研究团队在《Fungal Biology》发表的研究中，创新性地利用琥珀酸脱氢酶B亚基(succinate dehydrogenase subunit B, SdhB)的H277L突变，开发了基于第三代杀菌剂Boscalid的抗性选择系统。通过农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)，成功实现了两种病原菌的遗传改造，包括多基因敲除和表型互补实验，为病原菌功能基因组学研究提供了突破性工具。

关键技术包括：1) 基于同源重组构建含SdhB H277L突变的载体系统；2) 农杆菌介导的病原菌遗传转化；3) 利用Boscalid筛选阳性转化子；4) 通过黑色素合成相关基因AlScd1和ArPks1的互补实验验证系统有效性。

【研究结果】

1. 菌株与载体构建：以pTAR-hyg-0质粒为基础，构建了含SdhB H277L突变的pSDHB-H277L-lentis/rabiei系列载体，并在下游引入KpnI限制性酶切位点用于外源基因插入。

2. Sdh亚基鉴定：通过BLASTn分析在A. lentis和A. rabiei中分别鉴定了SdhB、SdhC和SdhD同源基因，其中A. lentis SdhB基因定位在M3J07_011204位点。

3. 转化验证：使用含Tef1启动子驱动的突变SdhB表达载体(pTAR-bos-0)，成功获得Boscalid抗性转化子，转化效率与常规 hygromycin B 标记相当。

4. 功能验证：通过互补实验恢复ΔAlScd1和ΔArPks1突变体的黑色素合成表型，证实该系统可用于基因功能恢复研究。

5. 多基因操作：首次在A. lentis中实现双基因敲除，突破了该物种仅能进行单基因操作的局限。

【结论与意义】
该研究建立的Boscalid抗性标记系统解决了A. lentis遗传改造工具单一的核心瓶颈，使研究人员能够：1) 同时研究多个效应蛋白基因的协同作用；2) 通过基因互补验证基因功能；3) 在天然宿主背景下研究病原菌致病机制。特别是SdhB突变体与目的基因的共转化策略，可确保外源基因在基因组安全位点整合，避免随机插入导致的表达变异。

这一技术突破为深入解析壳二孢属真菌的致病分子机制提供了关键工具，将显著促进扁豆和鹰嘴豆抗病品种的选育进程。研究团队特别指出，该方法可推广至其他植物病原真菌的遗传改造，具有广泛的适用前景。