基于Cre-loxP重组系统的微型环状DNA载体构建及其在CHO细胞基因敲入中的高效应用

本研究针对传统质粒载体在哺乳动物细胞基因敲入中效率低下的问题，开发了基于Cre-loxP重组系统的微型环状DNA（MC）制备技术。通过优化突变型loxP位点反应条件，成功实现质粒骨架的高效切除，并利用残留loxP序列实现CHO细胞基因组位点特异性整合。实验表明MC载体可使基因整合效率显著提升，为重组细胞生产提供了新策略。

　　

在基因治疗和重组蛋白生产领域，如何将外源基因高效、稳定地整合到宿主细胞基因组中一直是核心挑战。传统质粒载体因含有大量细菌序列，易引发宿主免疫反应且整合效率低下。而微型环状DNA（minicircle DNA, MC）作为去除了细菌骨架的超螺旋结构，具有转染效率高、表达持久的优势，但其制备工艺复杂制约了临床应用。

针对这一瓶颈，日本的研究团队在《Journal of Bioscience and Bioengineering》发表创新成果。他们利用Cre-loxP位点特异性重组系统的独特性质，开发出高效制备MC的新方法：将目标基因片段插入含突变型loxP位点（loxA/loxB）的质粒载体，通过Cre重组酶介导的切割反应去除细菌骨架。更巧妙的是，残留的loxP序列可继续介导MC与CHO细胞基因组的精准整合。研究证实，这种"一箭双雕"的设计使基因整合效率较传统质粒提升显著，为工业化生产重组蛋白细胞株提供了新工具。

关键技术包括：1）构建含不对称突变loxP位点（loxA/loxB）的质粒载体；2）体外优化Cre-loxP重组反应条件；3）利用残留loxP序列实现CHO细胞基因组靶向整合。

【Plasmid construction】
通过化学合成引入左臂突变loxA和右臂突变loxB的DNA序列，构建pUC57/loxA_loxB基础载体。随后插入包含PchEF1α启动子、scFv-Fc抗体基因和polyA尾的表达单元，形成完整的MC前体质粒。

【Evaluation of in vitro Cre-loxP reaction】
研究发现突变型loxP位点的非对称设计可改变反应平衡：当loxA与loxB在Cre作用下发生分子内重组时，优先产生含单个loxP的MC产物，而非反向重复结构。通过调整ATP浓度、反应时间等参数，最终实现>90%的MC转化效率。

【CRediT authorship contribution】
通讯作者Masamichi Kamihira教授团队在生物反应器工程领域具有深厚积累，第一作者Yoshinori Kawabe主要负责方法学开发和数据分析，合作者Makoto Hamaoka等参与了实验验证。

该研究突破性地将Cre-loxP系统同时应用于MC制备和后续基因组整合两个关键环节。实验数据显示，MC转染的CHO细胞其抗体表达量较传统质粒提高3倍以上，且拷贝数变异显著降低。这种"制备-应用"一体化策略不仅简化了生产流程，更通过保留loxP的"分子粘扣带"特性实现了精准基因组编辑，为基因治疗载体设计和细胞工厂构建提供了新范式。研究获得日本AMED和JSPS的基金支持，技术路线已具备工业化放大潜力。