甜菊来源蔗糖合酶SrSUS1的鉴定与工程化改造及其在糖基化合成中的应用

本研究针对糖基化反应中核苷二磷酸(NDP)-糖供体不足的瓶颈问题，通过转录组测序从甜菊中鉴定出蔗糖合酶(SuSy)基因SrSUS1，并采用共识序列策略获得活性提升3.6倍的突变体SrSUS1T49A/L90P/V104E 。该变体与糖基转移酶(UGT)偶联后，在一锅双酶体系中高效合成2-苯乙基-β-D-吡喃糖苷(43.63 g/L)和莱鲍迪苷M(93.35 g/L)，为工业级糖基化生产提供了新型生物催化剂。

　　

在天然产物合成领域，糖基化修饰犹如给分子"穿上糖衣"，能显著改善化合物的水溶性和生物活性。这一过程依赖尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGTs)的催化，但这类酶的工业化应用长期受限于昂贵的核苷二磷酸(NDP)-糖供体。传统化学合成法需要繁琐的保护-去保护步骤，而生物催化法虽具有区域和立体选择性优势，却因天然蔗糖合酶(SuSy)的热稳定性差、有机溶剂耐受性低等问题难以规模化。更棘手的是，许多需要糖基化的底物（如萜类和黄酮）水溶性极低，必须添加DMSO等助溶剂，这进一步限制了酶催化体系的稳定性。

针对这些挑战，来自江苏基础合成生物学研究中心等机构的研究团队将目光投向甜菊——这种以生产甜菊糖苷闻名的植物可能蕴藏着高性能SuSy。通过转录组测序和共识序列工程，研究人员成功开发出具有工业应用潜力的新型糖基化生物催化剂。

研究主要采用Illumina RNA测序技术分析5个甜菊栽培品种的叶片转录组，通过基因克隆实现SuSy在大肠杆菌中的异源表达，运用共识序列策略进行理性设计改造，并采用酶动力学分析评估突变体性能。关键实验还包括与糖基转移酶UGTAn85_Q23E/N65D
和UGT76G4的偶联反应，通过高效液相色谱(HPLC)监测产物生成。

RNA提取和Illumina测序
从5个高产莱鲍迪苷D/M的甜菊栽培种(HDM1-HDM3、HRD、HRM)叶片中提取RNA，建库测序获得5410-6237万条高质量reads，为后续基因挖掘奠定基础。

甜菊候选SuSys的表达分析
转录组分析鉴定出3个SuSy候选基因，其中SrSUS1在大肠杆菌中成功表达并显示活性，最适反应条件为55°C、pH 7.0，展现出优于多数植物源SuSy的热稳定性。

结论
通过共识序列工程获得的SrSUS1_{T49A/L90P/V104E}
变体，其酶活提升3.6倍，对蔗糖的K_m
值降至52.32 mM，热稳定性和催化效率显著改善。与工程化糖基转移酶偶联后，在一锅双酶分批补料反应中，24小时内分别实现163.32 mM 2-苯乙基-β-D-吡喃糖苷和72.29 mM莱鲍迪苷M的高效合成，后者产量折合93.35 g/L，创下文献报道的新高。

这项研究的意义在于：首次从甜菊中发掘出具有工业应用潜力的SuSy，通过理性设计突破天然酶的性能限制；建立的"SuSy-UGT"偶联系统为糖苷类化合物生产提供了高效、环保的合成路径；特别值得注意的是，工程化SrSUS1在55°C下保持稳定的特性，完美匹配工业生产中提高底物溶解度的需求。该成果发表于《Journal of Biotechnology》，为糖基化生物制造提供了新的工具酶和工艺范式。