黄素二铁蛋白中O2 和NO还原的能量调控机制：第二配位层配体变异的调控作用

本研究针对黄素二铁蛋白(FDPs)催化O2 和NO还原活性差异的分子机制，通过密度泛函理论(DFT)计算比较了Thermotoga maritima和Desulfovibrio gigas两种FDPs的活性位点模型。研究发现第二配位层酪氨酸残基通过氢键调控关键过渡态能垒，揭示了NO还原速率差异的结构基础，为理解FDPs家族催化多样性提供了新视角。

　　

黄素二铁蛋白(Flavodiiron proteins, FDPs)是一类广泛存在于所有生命领域的非血红素二铁酶，在生物体的氧和一氧化氮解毒过程中发挥关键作用。这类酶能高效催化O₂
还原为H₂
O，以及NO还原为N₂
O，但其催化活性和底物偏好性在不同物种间存在显著差异。尽管FDPs的二铁活性中心第一配位层高度保守，但第二配位层的氨基酸组成却存在明显变异，这种结构差异如何影响催化活性一直是领域内亟待解决的科学问题。

针对这一关键问题，瑞典斯德哥尔摩大学的研究团队在《Journal of Inorganic Biochemistry》发表了重要研究成果。研究人员采用密度泛函理论(DFT)计算方法，构建了Thermotoga maritima (Tm)和Desulfovibrio gigas (Dg)两种FDPs的活性位点模型，系统比较了它们催化O₂
和NO还原的能量图谱。研究特别关注第二配位层配体变异对反应能垒的调控作用，并通过计算Tm FDP的Y264S和Y197F突变体模型，深入分析了关键酪氨酸残基的功能机制。

研究方法上，团队采用B3LYP-D3泛函进行几何优化，使用B3LYP*-D3泛函进行高精度单点能量计算。通过固定部分原子坐标模拟蛋白质环境，并引入自洽反应场方法估算蛋白质环境的极化效应。关键过渡态通过分步扫描和优化确定，能量数据经零点能校正，并考虑了气相分子的熵变效应。

研究结果首先揭示了O₂
还原的共性机制。比较Tm和Dg FDPs模型发现，过氧中间体经单电子还原后，O-O键断裂能垒均较低（Tm: 8.8 kcal/mol，Dg: 6.8 kcal/mol），表明第二配位层变异对O₂
还原速率差异影响有限。这与实验观测到的Dg FDP较高k_cat
值(51 s^-1
)与Tm FDP(4 s^-1
)的差异不符，提示O₂
递送或质子转移等活性位点外过程可能是决定因素。

在NO还原研究中，团队发现关键差异：Dg FDP特有的Tyr26通过氢键稳定旋转中的次硝酸盐过渡态，使限速步骤能垒(13.5 kcal/mol)显著低于Tm FDP(15.6 kcal/mol)。这一发现完美解释了Dg FDP更高的NO还原活性(k_cat
=15 s^-1
)相比Tm FDP(0.6 s^-1
)。对Tm FDP突变体的计算显示，Y197F突变会消除对次硝酸盐的氢键稳定作用，使能垒升高至21.5 kcal/mol；而Y264S突变则通过减弱Fe_P
-NO键强度，间接降低能垒至11.8 kcal/mol。

研究结论创新性地提出了FDPs中第二配位层残基调控催化活性的三种模式：(1)直接氢键型（如保守Tyr197和Dg特有Tyr26），通过稳定过渡态降低能垒；(2)间接调控型（如Tm的Tyr264和Dg的Trp263），通过影响铁配体键强度改变底物结合能；(3)空间位阻型（如E. coli的Ser262），通过减小侧链体积优化底物取向。这些发现不仅阐明了FDPs家族催化多样性结构基础，也为设计调控酶活性的蛋白质工程策略提供了理论依据。

该研究的突破性在于首次系统揭示了第二配位层变异如何精细调控FDPs催化活性，解决了长期困扰领域的"保守活性中心与多变催化效率"的矛盾。特别是指出NO还原速率主要受活性位点内能垒控制，而O₂
还原速率可能由活性位点外过程决定，这一发现为后续实验研究指明了新方向。研究建立的DFT计算框架也为其他金属酶催化机制的解析提供了方法学参考。