基于多重PCR和焦磷酸解技术的Aspyre临床肺癌血液检测方法学验证：血浆cfDNA/cfRNA中可干预NSCLC变体的高灵敏度检测

针对非小细胞肺癌(NSCLC)液体活检中样本质量要求高、检测周期长等技术瓶颈，研究人员开发了基于多重PCR和焦磷酸解技术的Aspyre临床检测方法。该研究通过构建人工样本和临床样本验证，证实其对血浆cfDNA/cfRNA中114种NSCLC相关变异(包括SNV、indel、基因融合和MET外显子14跳跃)的检测灵敏度达0.25% VAF(SNV)和6拷贝(融合)，特异性100%，为NSCLC精准诊疗提供了快速(2天)、经济高效的分子分型方案。

　　

肺癌作为全球死亡率最高的恶性肿瘤，其诊疗面临严峻挑战。尽管近年来靶向治疗显著改善了非小细胞肺癌(NSCLC)患者的预后，但约70%携带可干预基因变异的患者未能获得精准治疗，主要归因于传统组织活检的局限性：侵入性强、肿瘤异质性影响、样本质量要求高且获取周期长。液体活检通过分析血液中的循环肿瘤核酸(cfDNA/cfRNA)为这一困境提供了突破方向，但现有检测方法如NGS存在成本高、流程复杂等问题，而常规PCR检测覆盖变异有限。

针对这一临床需求，Biofidelity公司的研究团队在《The Journal of Liquid Biopsy》发表了Aspyre临床肺癌血液检测的验证研究。该技术基于创新的焦磷酸解(Pyrophosphorolysis)原理，通过高度特异的逆转录聚合酶反应，实现了对11个NSCLC相关基因(ALK、BRAF、EGFR等)114种临床相关变异的一次性检测。研究采用人工构建样本和临床样本队列，通过极限检测(LoD)、特异性、准确性、精密度等多维度验证，证实该方法在标准输入量(20 ng cfDNA/42 ng cfRNA)下可稳定检测0.25% VAF的SNV、0.4% VAF的indel、6拷贝的基因融合和100拷贝的MET外显子14跳跃事件，且不受血红蛋白等血液成分干扰。

关键技术方法包括：1) 使用Paxgene ccfDNA采血管收集健康志愿者和NSCLC患者血浆样本；2) Zymo Research试剂盒同步提取cfDNA/cfRNA；3) 基于焦磷酸解原理的多重PCR/RT-PCR检测体系；4) 罗氏Avenio ctDNA靶向测序作为正交验证方法；5) 云计算支持的数据分析流程。

【2.1 检测原理】
研究阐明了Aspyre技术的核心机制：焦磷酸解反应可特异性作用于完全互补的DNA双链，而几乎完全被错配阻断。这种特性使其能在大量背景DNA中实现单分子级检测灵敏度。检测覆盖NCCN指南推荐的所有一线NSCLC生物标志物，包括DNA层面的SNV/indel和RNA层面的基因融合/MET外显子14跳跃。

【2.2 检测灵敏度】
通过两阶段验证(估计阶段5重复/确认阶段20重复)，证实标准输入量下各变异类别的中位检测限(LoD₉₅
)：SNV≤0.25% VAF(如KRAS G12C)、indel≤0.4% VAF(如EGFR E746_A750del)、基因融合≤6拷贝(如EML4-ALK)、MET外显子14跳跃≤100拷贝。低输入量(5 ng cfDNA/6 ng cfRNA)时灵敏度仍保持≤0.8% VAF(SNV/indel)和6拷贝(融合)。

【2.3 特异性验证】
31名健康志愿者样本(6840个变异位点)检测显示零假阳性，样本水平特异性100%(95%CI 0-6%)。扩大至所有验证实验的阴性样本(n=384 DNA/383 RNA)，假阳性率仅0.26%(RNA)和0%(DNA)。

【2.4 准确性评估】
对比人工样本和44例NSCLC患者临床样本的正交检测结果，阳性符合率(PPA)达94%(DNA)和88%(RNA)，阴性符合率(NPA)均为100%。值得注意的是，所有双变异样本(如EGFR T790M+L858R)均被准确检出。

【2.5 精密度表现】
不同操作员、试剂批次、仪器间的重复实验显示100%的批内和批间一致性，证实该方法的高度标准化。

【2.6 抗干扰能力】
血红蛋白(1 μg/μL)和免疫球蛋白G(150 pg/μL)的添加未影响检测结果，证明其对血液残留成分的稳定性。

研究结论指出，Aspyre技术通过将PCR的简便性与焦磷酸解的超高特异性结合，创造了检测性能与操作便捷性的新平衡。其两天周转时间、双核酸(cfDNA/cfRNA)同步分析能力，特别适合无法获取组织样本或需要快速分子分型的NSCLC患者。与Guardant360等现有液体活检相比，该技术在低输入量下仍保持更高灵敏度(0.8% vs 1.8% VAF)，且独有的RNA分析能直接验证融合基因的致病性。

讨论部分强调，该研究存在临床融合基因样本不足的局限，但通过系统的人工样本验证弥补。未来通过FDA认证和更大规模临床验证后，该技术有望成为改善NSCLC精准医疗可及性的关键工具，特别是为医疗资源匮乏地区提供经济高效的解决方案。研究数据已保存于NCBI SRA(PRJNA1235103)，为后续方法学比较研究提供基准。