Sf9/Sf21昆虫细胞培养与BEVS重组蛋白表达：新手操作指南与疑难解析

为解决昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)操作复杂、现有protocols不完整等问题，波兰Adam Mickiewicz大学团队联合三家实验室开发了适用于新手的Sf9/Sf21细胞培养全流程方案。研究整合20年经验实验室的技术积累，优化了MultiBac系统操作、病毒扩增策略及蛋白表达条件，成功表达人CSTF剪切多聚腺苷酸化复合体，为生物医学研究提供标准化操作框架。

　　

在生物医学研究和制药领域，重组蛋白不仅是关键的研究工具，更是治疗性药物的重要组成部分。然而，如何高效、经济地生产具有正确折叠和翻译后修饰的重组蛋白，一直是困扰研究人员的难题。虽然大肠杆菌表达系统成本低廉，但难以实现真核蛋白的复杂修饰；哺乳动物细胞虽能产生天然样蛋白，却面临产量低、成本高的困境。昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)因其兼具真核修饰能力和较高产量，逐渐成为折中方案中的优选，但实际操作中仍存在培养条件苛刻、技术门槛高等问题。

针对这些挑战，Adam Mickiewicz大学的研究团队联合波兰科学院生物化学与生物物理研究所、德国马丁路德大学等机构，在《Scientific Reports》发表了针对新手的Sf昆虫细胞培养全流程指南。这项研究特别整合了两家具有20年BEVS操作经验的实验室与一家新建立系统的实验室的实践智慧，形成了从细胞培养、病毒扩增到蛋白表达的标准化操作体系。

研究主要采用MultiBac多基因表达系统，通过Cre-loxP重组和Tn7转座技术构建重组杆状病毒基因组；使用Sf9/Sf21细胞进行病毒扩增和蛋白表达，通过噬斑测定(PFU)计算病毒滴度；采用镍柱亲和层析和阴离子交换层析纯化目标蛋白。其中Sf9细胞因其对高密度培养的耐受性被选为主要表达宿主，而Sf21细胞凭借清晰的噬斑形成能力用于病毒滴度测定。

在"昆虫细胞培养"部分，研究比较了Sf9与Sf21细胞的生物学特性：Sf9细胞源自Sf21细胞系，形态更规则，对培养条件变化和高密度悬浮培养具有更强耐受性，适合大规模病毒扩增和蛋白表达；而Sf21细胞对杆状病毒感染更敏感，形成的噬斑更清晰，适用于病毒滴度测定。团队特别强调，Sf9细胞可形成多层生长状态，而Sf21细胞汇合度超过80%就会影响状态。

关于"杆状病毒生命周期与BEVS开发"，研究详细阐述了AcMNPV病毒的双相生活史：早期产生出芽型病毒粒子(BVs)用于系统感染，晚期形成包含体衍生病毒粒子(ODVs)用于环境传播。BEVS正是利用polh基因在极晚期的高表达特性，用外源基因替换这个非必需基因。团队采用DH10MultiBac细菌系统，通过多步重组构建同时携带mCherry报告基因和CSTF复合体基因的重组杆状病毒。

在"实验设计"部分，研究展示了创新的操作技巧：通过反复划线确认白色克隆（指示成功Tn7转座）、使用低感染复数(MOI 0.01-0.1)进行病毒扩增、在细胞活力降至60-70%时终止蛋白表达等。这些细节处理显著提高了系统稳定性，如表达的CSTF77、CSTF64和CSTF50亚基经镍柱和ResourceQ柱两步纯化后获得高纯度产物。

研究同时指出了系统的局限性：昆虫细胞产生的N-糖链以末端甘露糖为主，与哺乳动物的唾液酸化糖型存在差异；病毒编码的蛋白酶可能导致目标蛋白降解。对此，团队建议可采用转基因昆虫细胞系（如表达五种哺乳动物糖基转移酶的SfSWT-1细胞）或删除病毒蛋白酶基因（如chiA和v-cath）来优化。

与其它表达系统相比，BEVS在产量、成本和修饰能力间取得了平衡。细菌系统虽产量高但缺乏真核修饰；酵母系统折中但糖基化仍不理想；哺乳动物细胞是"金标准"但成本高昂。本研究提供的标准化protocol使BEVS更易被实验室采纳，特别是通过详细记录常见问题（如细胞贴壁环形成、支原体污染预防）和解决方案，大幅降低了使用门槛。

这项研究的意义在于：首次整合多实验室经验形成面向新手的BEVS全流程指南；建立Sf9/Sf21细胞的标准化培养参数；开发针对多蛋白复合体表达的优化方案。这些成果不仅适用于基础研究（如文中展示的RNA加工复合体重构），也为重组蛋白药物的开发提供了技术支撑。特别值得注意的是，研究强调的"经验性技巧"——如玻璃器皿清洗程序、病毒保存条件等——往往是常规protocols中缺失却决定成败的关键细节。