冷冻电镜揭示RNA聚合酶I在无碱基DNA损伤位点的顺序性暂停和停滞机制

本研究通过冷冻电镜技术解析了RNA聚合酶I(Pol I)在无碱基(Abasic, Ap)DNA损伤位点的暂停和停滞机制。研究人员发现Pol I通过独特的桥螺旋碱基夹层机制缓慢添加嘌呤核苷酸，并首次观察到其E位点结构。该研究揭示了Pol I与Pol II在应对Ap位点时的差异，为理解核糖体RNA合成中的DNA损伤修复提供了重要结构基础。

　　

基因组稳定性对细胞稳态至关重要，而无碱基(Ap)位点作为真核细胞中最常见的DNA损伤类型，每天在每个细胞中产生约10，000个。这些损伤主要来源于自发脱嘌呤或碱基切除修复(BER)缺陷，若不及时修复可能导致转录中断和基因组不稳定。虽然RNA聚合酶II(Pol II)应对Ap位点的机制已有研究，但负责核糖体RNA合成的RNA聚合酶I(Pol I)的响应机制仍不清楚。西班牙国家研究委员会等机构的研究人员通过冷冻电镜和生化分析，首次系统揭示了Pol I在Ap位点的停滞机制，相关成果发表在《Nature Communications》。

研究主要采用冷冻电镜技术解析了酵母Pol I在Ap位点的多种构象状态(分辨率2.8-3.5?)，结合体外转录实验分析核苷酸添加偏好性。使用含有四氢呋喃模拟Ap位点的DNA模板构建延伸复合物，通过时间梯度实验比较Pol I与Pol II的转录延伸差异。

Pol I stalls at abasic sites and cleaves slowly-inserted purines
体外转录实验显示，Pol I在Ap位点对侧缓慢添加嘌呤核苷酸(偏好腺苷酸，比例1A:0.5G:0.1T:0.1U)，但后续延伸严重受阻。与Pol II不同，Pol I表现出更强的RNA剪切活性和更低的损伤位点跨越能力，表明其独特的质量控制机制。

Structure of Pol I paused at an abasic site
冷冻电镜结构捕获了Pol I在Ap位点的两种构象：闭合态(裂隙宽度28?)和开放态(32?)。在闭合暂停复合物(Ap-PEC)中，Ap位点成功跨越桥螺旋进入模板位点(i+1)，而DNA/RNA杂合链发生倾斜。与CPD损伤不同，Ap位点允许核苷酸添加后再停滞。

The A12 C-terminal Zn ribbon inserts in the funnel to catalyze RNA cleavage
在Ap-RCC结构中，A12羧基端锌带(A12-Ct)插入酶漏斗区域，触发裂隙部分开放(30?)。这种构象与Pol II-TFIIS复合物类似，为Pol I的RNA剪切活性提供了结构基础，解释了实验中观察到的剪切产物。

Structures of Pol I lacking lobe-associated subunits
发现两种缺失亚基的Pol I变体：Ap-PEC*(缺失A49/A34.5异源二聚体)和Ap-PEC**(额外缺失A12)。后者显示A190颌结构域高度灵活，使下游DNA暴露，可能有利于修复因子接近损伤位点。

Purine addition occurs via base stacking
冷冻电镜捕获了AMPCPP在A位点和E位点的结合状态。在Ap-NAC结构中，腺嘌呤被RNA 3'端和桥螺旋T1013夹住，保守残基P593解释了嘌呤偏好性。首次观察到Pol I的E位点结构，其β/γ磷酸结合位点与A位点重叠。

Structure of Pol I stalled after addition opposite an abasic site
Ap-SEC结构显示添加腺嘌呤后的停滞机制：DNA碱基倾斜30°与RNA形成氢键，导致i+1位点核苷酸位于桥螺旋后方，形成独特的"回缩暂停"状态。这种中间转运状态阻碍了后续核苷酸添加。

研究表明Pol I通过顺序机制应对Ap位点：首先缓慢添加嘌呤(主要腺嘌呤)，随后因转运障碍和RNA剪切而停滞。这种机制与Pol II显著不同，可能反映了核糖体RNA合成的高保真需求。A49/A34.5异源二聚体的可逆解离和A12的构象变化在调控中起关键作用。该研究不仅阐明了Pol I在DNA损伤应答中的独特策略，也为理解转录-修复耦合机制提供了新视角。特别值得注意的是，Pol I的E位点结构和桥螺旋在核苷酸选择中的作用为开发靶向rRNA合成的药物提供了潜在靶点。