人类线粒体拓扑异构酶1的低内切核糖核酸酶活性与缺乏rNMP偏好性保护线粒体基因组免受核糖核苷酸依赖性缺失的影响

本研究针对线粒体DNA(mtDNA)中核糖核苷酸(rNMP)耐受性机制展开探索。研究人员通过比较人类线粒体拓扑异构酶1(hTOP1MT)与核型拓扑异构酶1(hTOP1)的酶学特性，发现hTOP1MT具有较低的内切核糖核酸酶活性和DNA结合亲和力，且缺乏对rNMP的切割偏好性，这解释了为何mtDNA能耐受rNMP而不产生2-5 bp缺失突变。该发现为理解线粒体基因组稳定性机制提供了新视角。

　　

在细胞中，核糖核苷酸(rNMP)被错误掺入基因组DNA的现象普遍存在，但有趣的是，这种"错误"在不同细胞区室中产生了截然不同的后果。核基因组中的rNMP会导致严重的基因组不稳定性，包括DNA断裂和在重复序列处产生2-5 bp的短缺失。然而，人类线粒体基因组(mtDNA)通常每个分子含有多个rNMP，却未观察到类似的损害效应。这种差异引发了科学家的浓厚兴趣，因为线粒体作为细胞的能量工厂，其基因组稳定性对细胞功能至关重要。

瑞典于默奥大学医学生物化学与生物物理学系的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究揭示了这一现象背后的分子机制。研究人员注意到，核基因组的不稳定性表型依赖于核拓扑异构酶1(hTOP1)的活性，而哺乳动物线粒体中存在一个独特的拓扑异构酶1旁系同源物(hTOP1MT)。这提示两种细胞区室中拓扑异构酶1的不同特性可能是导致rNMP产生差异效应的关键。

为验证这一假设，研究人员系统比较了hTOP1MT和hTOP1的酶学特性。研究发现hTOP1MT虽然能够松弛超螺旋DNA，但其内切核糖核酸酶活性显著低于hTOP1。稳态动力学分析显示，hTOP1MT在rNMP位点的最大反应速度(V_max
)比hTOP1低21倍。更重要的是，hTOP1能够被吸引到共识切割位点之外的rNMP处进行切割，而hTOP1MT则严格遵循共识切割位点。这些特性使得hTOP1MT很少在重复序列处产生rNMP依赖性的短缺失突变，从而解释了mtDNA对rNMP的耐受性。

研究采用了多项关键技术：重组蛋白表达与纯化技术用于获得高纯度TOP1酶；DNA松弛实验评估酶的基本活性；荧光各向异性测定分析蛋白-DNA相互作用；稳态动力学分析定量比较酶活性；以及特异性设计的DNA底物用于精确评估内切核糖核酸酶活性和缺失突变形成效率。

研究结果部分通过多个精心设计的实验揭示了hTOP1MT的独特性质：

"hTOP1MT exhibits endoribonuclease activity"部分证实，虽然hTOP1MT具有内切核糖核酸酶活性，但其在rNMP位点的切割效率显著低于hTOP1。在含有共识切割位点AGAT↓的DNA底物上，hTOP1MT产生的18-nt切割产物明显少于hTOP1。

"hTOP1MT and hTOP1 differ in their propensity to act at an upstream rNMP"部分发现，hTOP1能够被吸引到共识切割位点上游的rGMP处进行切割，而hTOP1MT则严格遵循共识切割位点。这一差异对缺失突变的形成具有重要影响。

"hTOP1MT exhibits lower DNA binding affinity than its nuclear paralog"部分通过荧光各向异性实验证明，hTOP1MT对所有测试DNA底物的结合亲和力都比hTOP1低3-9倍，这可能是其切割效率较低的原因之一。

"In contrast to hTOP1 and scTOP1, hTOP1MT action rarely leads to rNMP-dependent deletions"部分最终证实，在重复序列上，hTOP1MT产生的缺失产物(32-mer)仅为hTOP1的三分之一，说明其很少引发rNMP依赖性的缺失突变。

研究结论部分指出，hTOP1MT的低内切核糖核酸酶活性和缺乏rNMP偏好性共同保护mtDNA免受rNMP诱导的缺失突变。这一发现解释了为何mtDNA能够耐受rNMP而不表现出核基因组中的不稳定性表型。研究还提出了三种可能的解释：线粒体基因组的多拷贝特性、DNA聚合酶γ的反转录酶活性，以及本研究发现hTOP1MT特性。这些发现不仅增进了对线粒体基因组稳定性机制的理解，也为解释不同物种间mtDNA对rNMP反应的差异提供了分子基础。

该研究的科学意义在于首次系统比较了核与线粒体拓扑异构酶1对rNMP处理的不同策略，揭示了细胞区室化在基因组维持中的精细调控机制。这些发现可能对理解线粒体相关疾病的发病机制和开发针对性治疗策略具有潜在价值。