螺蛳AMP脱氨酶底物选择性的结构基础与嵌合ADGF腺苷脱氨酶的工程化改造

研究人员针对ADGF家族酶类底物选择性的分子机制不明问题，聚焦软体动物Helix pomatia AMP脱氨酶(HPAMPD)的结构与功能研究。通过X射线晶体学解析其apo状态及与pentostatin/PMP复合物结构，发现磷酸基团结合关键位点，并成功构建兼具AMP/腺苷双活性的嵌合酶Chimera-2。该研究首次阐明ADGF家族核苷酸偏好性的结构基础，为设计多功能脱氨酶提供新思路。

　　

在生命活动中，腺苷及其衍生物的代谢调控至关重要。腺苷脱氨酶(ADA)家族通过催化腺苷(Ado)和AMP的脱氨反应，维持嘌呤代谢平衡。人类拥有六种功能各异的ADA同源酶，包括专一性作用于腺苷的ADA1/2、偏好AMP的AMPD1-3，以及特异性处理N6-甲基AMP(6mAMP)的ADAL1/MAPDA。这些酶的底物选择性决定其生理功能——例如ADA1缺陷会导致严重联合免疫缺陷(SCID)，而ADA2突变则与血管炎等自身炎症性疾病相关。然而，ADGF（腺苷脱氨酶相关生长因子）亚家族成员为何表现出截然不同的底物偏好性，其结构基础长期未明。

这一科学谜题在软体动物Helix pomatia（罗马蜗牛）中发现特殊酶HPAMPD后迎来转机。与传统ADGF不同，HPAMPD优先催化AMP而非腺苷的脱氨反应，成为ADGF家族中首个"叛逆者"。为揭示其分子机制，新英格兰生物实验室与德克萨斯大学的研究团队展开联合攻关，相关成果发表于《Journal of Biological Chemistry》。

研究采用X射线晶体学（分辨率1.6-1.75 ?）解析HPAMPD的apo结构及其与过渡态类似物pentostatin（2′-脱氧柯福霉素）和pentostatin-5′-单磷酸(PMP)的复合物结构。通过分子动力学模拟分析磷酸基团结合特征，并构建嵌合酶Chimera-2进行功能验证。酶动力学实验（Kalckar法）测定_K
m
/_k
cat
值，AlphaFold预测细菌KomA结构辅助进化分析。

结构基础揭示ADGFs底物特异性
HPAMPD与人类ADA2结构相似（RMSD 1.2 ?），但通过三个关键区域实现AMP偏好性：(1)β1链后环（T125/R223）；(2)αH-αI间环（Y227/R232）；(3)β5链末端（S256）。这些位点的极性/带电荷残基形成"磷酸结合口袋"，而ADGF中对应残基多为疏水性。晶体结构显示PMP的磷酸基团与Y227直接氢键，并通过水分子网络与D124、T125、R223、S256相互作用。

嵌合ADGF获得双底物活性
将HPAMPD的β1-β5区域（含上述三个元件）移植到海兔ADGF中，构建的Chimera-2对AMP的_K
m
=108 μM（_k
cat
=38 s^-1
），对腺苷_K
m
=39 μM（_k
cat
=17.7 s^-1
），实现功能转换。结构分析证实Chimera-2完美保留了HPAMPD的磷酸结合模式（图6I），同时保持ADGF的腺苷催化核心。

6mAMP识别的结构约束
HPAMPD对6mAMP活性仅为AMP的1.7%（Chimera-2更降至0.2%）。比较Arabidopsis
MAPDA结构发现，6mAMP的N6-甲基需要L55/V57/T269/F300构成的疏水腔容纳，而HPAMPD对应位置为W212/F215/L425/W456的芳香族残基，空间位阻导致甲基排斥。

这项研究首次阐明ADGF家族底物选择性的结构密码：保守的锌离子配位（H121/H123/H366/D451）维持催化核心，而可变环区决定核苷酸/核苷偏好性。嵌合酶设计策略为开发多功能脱氨酶提供新思路，其应用前景包括：①治疗ADA2缺乏相关血管病变；②调控细胞外腺苷信号（如肿瘤微环境）；③开发RNA修饰（m6A）代谢工具。特别值得注意的是，研究发现的磷酸结合模式在人类AMPD2（PDB 8HU6）和ADAL1（PDB 8QCH）中高度保守，暗示不同进化分支采用相似策略实现底物分化。对细菌KomA的结构预测（RMSD 1.7-1.8 ? vs ADAL1）更将这类酶的功能研究拓展至原核生物抗病毒防御领域。

论文最后探讨了ADA2临床突变（如G47R/W、E328K、T360A等）的致病机制——这些变异多发生在二聚界面或核心稳定网络（图S6），通过破坏蛋白折叠而非直接影响活性位点导致功能丧失。这为开发变构调节剂治疗ADA2缺乏症提供了潜在靶点。研究团队特别指出，HPAMPD作为迄今发现唯一能同时处理AMP/腺苷/6mAMP的ADGF成员，其"多功能性"可能反映软体动物特殊的嘌呤代谢需求，为酶分子进化研究提供了精彩案例。