糖基化工程改造HCV E2糖蛋白提升免疫原性及中和抗体效价的研究

本研究针对丙型肝炎病毒(HCV)疫苗开发中E2糖蛋白糖基异质性影响免疫原性的关键问题，通过构建糖基化工程改造的CHO(geCHO)细胞系，系统评估了不同糖型sE2抗原的生化特性与免疫效果。研究发现特定糖型可显著增强中和抗体(HC84.26/AR3A)结合能力达8倍，其中geCHO.sE2.1免疫小鼠血清对同源HCVpp的中和效价(ID50 )提升7倍，并展现更广谱的基因型交叉中和活性。该成果为精准调控疫苗糖基化模式提供了重要范式。

　　

丙型肝炎病毒(HCV)感染全球影响着超过5000万人，每年新增病例约100万例，是导致肝硬化和肝癌的主要病因。尽管直接抗病毒药物(DAAs)能有效治疗，但再感染风险和高昂治疗成本使得预防性疫苗成为WHO消除肝炎战略的关键环节。HCV包膜糖蛋白E1E2复合物是中和抗体的主要靶标，但其表面密集的N-糖基化"糖盾"会遮蔽关键表位，而传统表达系统产生的糖型异质性可能影响疫苗效力。

美国马里兰大学等机构的研究团队在《npj Vaccines》发表研究，通过30种糖基化工程CHO(geCHO)细胞系制备均一糖型的E2胞外域(sE2)，系统评估了糖基结构对抗原性和免疫原性的影响。研究发现特定糖型可使中和抗体结合亲和力提升8倍，其中geCHO.sE2.1免疫小鼠血清对同源假病毒(HCVpp)的中和效价(ID₅₀
)提高7倍，并展现更广谱的基因型交叉中和活性。更令人惊讶的是，某些糖型会完全阻断E2与宿主受体CD81的结合，揭示了糖基修饰对病毒入侵的深层调控机制。

研究采用的主要技术包括：(1)构建12种geCHO细胞系表达不同糖型sE2；(2)质谱分析N-糖基组成；(3)分析超速离心(AUC)评估蛋白聚集状态；(4)ELISA检测抗体/受体结合特性；(5)聚磷酸酯佐剂(PCPP-R)免疫小鼠方案；(6)假病毒(HCVpp)和细胞培养病毒(HCVcc)中和实验。

初始筛选HCV E2糖型变体
通过低体积ELISA筛选12种geCHO细胞表达的sE2，发现geCHO.sE2.1和geCHO.sE2.7对中和抗体AR3A(靶向B表位域)和HC84.26(靶向D表位域)的结合亲和力分别提高8倍和6倍。去糖基化实验证实这些差异完全源于糖基修饰。

E2抗原的糖基谱分析
质谱分析显示geCHO.sE2.1中90%糖型分子量≤2605 Da，主要糖型(1794 Da)占36.2%；而geCHO.sE2.7主要糖型(2792 Da)占23%。相较之下，传统CHO和HEK293表达的sE2含有34%和11-20%的三/四天线复杂糖型。

E2抗原的生化分析
分析超速离心显示geCHO.sE2.1沉降系数(3.6 S)最均一，而传统CHO-sE2存在多个聚集态(1.8-8.1 S)。非还原Western显示geCHO抗原条带更窄，印证糖型均一性提升。

受体结合分析
geCHO.sE2.7完全丧失与CD81-LEL的结合能力，提示N2/N3/N6位糖基可能通过空间位阻或构象调控影响受体识别。这一意外发现首次揭示糖基修饰可直接影响HCV入侵机制。

免疫原性评估
虽然四组小鼠(各6只)的IgG总效价相当，但geCHO.sE2.1组血清对H77株(1a型)HCVpp的ID₅₀
显著提高7倍。更关键的是，该组有最多小鼠血清能中和1b/2a/2b/3a型假病毒，而geCHO.sE2.7组交叉中和能力最弱。

糖基-效价相关性分析
通过Spearman秩相关分析鉴定出6个关键糖型：1794 Da等5个小糖型与中和效价呈负相关(r≤-0.46)，而1661 Da糖型(含末端GlcNAc)与效价降低显著相关(r=0.53)。值得注意的是，糖型大小并非唯一决定因素，特定糖链结构(如末端半乳糖)对表位暴露更具调控作用。

该研究通过创新性的糖基化工程平台，首次系统阐明了HCV E2糖型特征与免疫原性的定量关系。geCHO.sE2.1中占优势的1794 Da单天线糖型被证明能最优平衡表位暴露与蛋白稳定性，其诱导的抗体不仅对同源病毒中和效价提升7倍，还能更广泛覆盖不同基因型。研究建立的糖型-效价相关性模型为理性设计疫苗糖基化模式提供了分子蓝图，而发现的糖基依赖性受体结合调控现象，则为开发新型HCV进入抑制剂开辟了途径。这些发现不仅适用于HCV疫苗开发，对HIV、流感等包膜病毒疫苗设计也具有重要借鉴价值。