一个新的水稻颖花开裂基因OsSG2的图位克隆与功能验证

　　

摘要：

【目的】 水稻颖花开裂突变体sg2（split glume 2）来源于三明市农业科学研究院自主选育的恢复系GK1327高世代育种群体的自然突变，通过对其颖花开裂基因OsSG2（Oryza sativa Split Glume 2）进行遗传学分析、图位克隆和功能验证，为进一步开展OsSG2在水稻花器官发育中的功能研究奠定基础和提供重要种质资源。【方法】 通过对突变体sg2颖花进行形态特征解剖观察，分析其花器官发育突变特点。通过对野生型WT（GK1327）与突变体sg2表型和农艺性状进行调查，以及花粉在I₂-KI溶液中的染色观察，分析该突变表型对主要产量性状和花粉育性的影响。利用突变体sg2分别与野生型WT和9311杂交，构建多个F₂分离群体，对OsSG2进行遗传学分析和物理定位。采用集群分离分析法（bulked segregant analysis，BSA）和二代测序（next-generation sequencing，NGS）相结合的BSA-seq技术，以及半定量PCR和实时荧光定量PCR对候选基因进行筛选和表达模式分析。结合PCR扩增和测序技术对候选基因进行克隆和序列分析。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术和转基因互补试验对OsSG2候选基因进行功能验证。【结果】 该突变体在生殖生长时期花器官发育出现明显异常，其颖花内外稃片瘪弱，表现出不同程度的扭曲变形，且开裂不抱合表型，穗部颖花发育不正常的比例达到100%。相比野生型，突变体sg2结实率和千粒重显著降低，种子萌发率显著下降，花粉育性未出现明显异常。遗传分析表明，sg2突变表型由单个细胞核隐性基因控制。通过图位克隆技术，将OsSG2精细定位在水稻第3染色体短臂端，位于2个InDel（insertion/deletion）标记InDel-12083和InDel-17610之间，物理距离为919.85 kb，该区间共注释75个开放阅读框（open read frames，ORFs）。利用BSA-seq技术，鉴定到一个潜在的OsSG2候选基因LOC_Os03g11614，该基因编码一个定位于细胞核的OsMADS1转录因子。表达和序列分析表明，相比野生型，LOC_Os03g11614在突变体sg2抽穗期幼穗中的表达水平极显著下调，且该基因编码序列（coding sequence，CDS）在突变体中发生单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）突变，即LOC_Os03g11614第1外显子第3个碱基由G突变为A，导致其起始密码子由ATG突变为ATA，进而影响该基因的转录表达和相应蛋白OsMADS1的结构和功能。CRISPR-Cas9基因编辑技术和功能互补试验进一步证实候选基因LOC_Os03g11614即为OsSG2。【结论】 鉴定并克隆获得的水稻颖花开裂基因OsSG2为一个新的OsMADS1等位突变基因。