单细胞RNA测序中免疫球蛋白同种型准确鉴定：基因组参考的祖先匹配至关重要

本研究针对单细胞RNA测序(scRNA-seq)中免疫球蛋白同种型(immunoglobulin isotypes)鉴定不准确的问题，通过比较GRCh38(hg38)与T2T-CHM13基因组参考的性能差异，发现祖先匹配的基因组参考能显著提高IGHG/IGHA亚型鉴定的准确性。研究证实"一细胞一抗体"理论，为免疫应答研究提供了关键方法学改进，成果发表于《NAR Genomics and Bioinformatics》。

　　

在免疫学研究领域，"一细胞一抗体"原则是理解适应性免疫的基石。这一由诺贝尔奖得主Burnet提出的理论认为，每个B细胞仅表达单一特异性的免疫球蛋白。然而随着单细胞测序技术的普及，研究人员在分析抗体分泌细胞(ASC)时发现一个令人困惑的现象：使用标准人类参考基因组GRCh38(hg38)时，大量细胞似乎同时表达多种免疫球蛋白同种型(如IGHG1+IGHG2+)，这与经典理论严重冲突。

Walter and Eliza Hall医学研究所的Junli Nie等研究者敏锐地意识到，这可能是基因组参考与样本祖先背景不匹配导致的系统误差。为此，他们系统比较了新发布的T2T-CHM13（首个完整人类基因组）与hg38在免疫球蛋白基因分析中的表现。研究发现，当欧洲来源的样本使用同样源自欧洲的T2T-CHM13参考时，所有ASC都严格遵循"一细胞一抗体"规律；而使用非洲祖先背景的hg38时，则出现大量假阳性双重表达。这一发现发表于《NAR Genomics and Bioinformatics》，为免疫组学研究提供了关键方法学启示。

研究团队采用多项关键技术：1）分析5个公共scRNA-seq数据集（含中国人群肠道黏膜样本）；2）构建hg38与T2T-CHM13的定制化Cell Ranger参考基因组；3）通过BAM文件解析比对质量指标（如AS映射分数、nM编辑距离）；4）利用IMGT/BlastSearch进行等位基因分型；5）开发GTF注释改良策略解决IGHA基因多重比对问题。

Mapping performance is comparable between hg38 and T2T
通过比对质量评估发现，hg38与T2T-CHM13在全基因组层面的映射性能相当，有效读数、PCR重复率和丢弃率均无显著差异。但在免疫球蛋白基因区域，T2T-CHM13展现出独特优势。

T2T but not hg38 identifies immunoglobulin isotypes correctly
关键发现显示：使用hg38时，高达759个BMPC细胞被错误判定为IGHG1+IGHG2+双阳性，而T2T-CHM13仅检出37个真实双连体细胞。类似现象存在于IGHG1+IGHG3+（1141 vs 0）和IGHA1+IGHA2+（50% vs 0）细胞中。

DP cells in the hg38 output should be single-positive
通过序列比对追踪发现，hg38中IGHG1的CH3-CHS外显子区域存在5个错配，导致本应映射到IGHG2-T2T的读数被错误分配。IGHA1的3'UTR区域也存在类似问题，产生假阳性信号。

The T2T reference results in more IGHG reads than hg38
T2T-CHM13的IGHG基因区变异位点更多（34 vs 28个），使得176万条因多重比对被hg38丢弃的读数得以准确映射，显著提高IGHG1/IGHG2的表达定量精度。

The impact of allele differences on isotype calling
等位基因分析揭示：T2T-CHM13携带欧洲人群高频单倍型IGHG3 * 11/IGHG1 * 03/IGHG2 * 02，而hg38对应非洲单倍型IGHG3 * 01/IGHG1 * 02/IGHG2 * 06。使用中国汉族基因组参考分析亚洲样本时，T2T-CHM13的欧洲偏倚同样导致IGHA2检出失败。

这项研究首次系统论证了基因组参考的祖先背景对免疫球蛋白分析的决定性影响。不仅验证了"一细胞一抗体"的理论正确性，更揭示了当前scRNA-seq分析中隐藏的系统误差来源。研究者开发的IGHA外显子分割策略，为高同源基因区的读数回收提供了范例。随着人类泛基因组计划的推进，该研究强调了个体化基因组参考在精准免疫研究中的必要性，为传染病应答、疫苗开发和自身免疫疾病研究提供了关键方法学基础。