植物根系分泌物4-羟基苯甲醛诱导农杆菌外排泵PecM表达以维持代谢稳态的机制研究

这篇研究揭示了农杆菌（Agrobacterium fabrum）通过外排泵PecM响应植物根系毒性物质4-羟基苯甲醛（4HBA）的分子机制。研究发现，4HBA特异性诱导pecM表达，而转录因子PecS通过抑制pecM/pecS操纵子调控这一过程。代谢组学证实4HBA在pecM缺陷菌株中积累，并干扰三羧酸循环（TCA）代谢流，表明PecM通过外排4HBA维持细菌在根际的代谢稳态，为其致病性奠定基础。

　　

植物毒性物质与细菌防御的分子博弈

ABSTRACT
农杆菌（Agrobacterium fabrum）作为冠瘿病的病原体，在根际环境中面临植物分泌的毒性化合物如4-羟基苯甲醛（4HBA）的挑战。研究发现，其外排泵PecM在4HBA诱导下特异性表达，而转录因子PecS通过自抑制调控这一过程。当PecM缺失时，4HBA在胞内积累并干扰中心代谢，揭示了细菌通过外排毒性物质维持代谢稳态的新机制。

INTRODUCTION
植物根际分泌的芳香族化合物（如4HBA和4-羟基苯甲酸酯4HB）既是毒性物质，也是细菌趋化和毒力基因诱导的信号分子。农杆菌通过β-酮己二酸途径降解这些化合物，但其调控网络尚不明确。PecS作为MarR家族转录因子，与外排泵基因pecM反向排列，形成独特的调控模块。

RESULTS

Disruption of pecM is associated with increased pecS expression
RT-PCR证实pecS与下游基因gntR、manR形成操纵子。尽管pecM缺失不影响细菌在富培养基中的生长，但静止期pecS表达显著升高，提示可能存在PecS配体的积累。

Increased pecS expression in pecM::Km cells is not due to the accumulation of purines
通过Amplex Red检测发现，已知PecS配体（尿酸和黄嘌呤）在pecM缺陷菌株中未显著积累，暗示另有诱导物存在。氯霉素（Cm）处理意外导致purine水平升高，可能与应激响应相关。

4-hydroxybenzaldehyde (4HBA) accumulates in pecM::Km cells
非靶向代谢组学显示，pecM缺陷菌株中4HBA、α-酮戊二酸和琥珀酸显著积累。4HBA的胞内滞留导致TCA循环中间产物失衡，证实PecM通过外排4HBA维持代谢稳态。

Gene expression patterns suggest 4HBA is a substrate for PecM
4HBA特异性诱导pecM表达（而非4HB），且过表达pecM会减弱降解基因pobA/pcaF的诱导。DNase I足迹实验和热稳定性分析证实4HBA并非PecS配体，暗示存在独立于PecS的4HBA响应调控因子。

4HBA is not a ligand for PecS
纯化的PecS蛋白在4HBA存在下未发生热稳定性改变，且DNA结合模式不变，排除了4HBA直接调控PecS的可能性。

An assessment of 4HBA toxicity
表型实验显示，pecM过表达菌株对高浓度4HBA更敏感，而大肠杆菌异源表达pecM后同样出现生长抑制，证实PecM的外排功能需要精确调控以避免"过度排毒"导致的膜损伤。

DISCUSSION

Cellular responses to chloramphenicol
氯霉素通过诱导mexEF-ameC外排泵和catB乙酰转移酶实现耐药，而PecM仅对高浓度Cm有微弱贡献，其生理意义有限。

Regulation of pecM expression
水平转移获得的pecS-pecM模块在不同病原菌中演化出差异化调控网络。4HBA通过未知转录因子（非PecS）激活pecM，这种"双保险"机制确保毒性物质外排的持续性。

Cellular responses to 4HBA
PecM缺陷导致4HBA经β-酮己二酸途径过度降解，造成琥珀酰-CoA积累并抑制α-酮戊二酸脱氢酶，最终扰乱TCA循环。这一发现为理解根际微生物的代谢适应性提供了新视角。

MATERIALS AND METHODS
研究采用GV3101菌株构建pecM敲除突变体（pecM::Km），通过代谢组学（LC-MS）、RT-qPCR和蛋白质互作分析（DNase I足迹法、差示扫描荧光法）等多技术联用，系统解析了4HBA-PecM调控轴的作用机制。

ACKNOWLEDGMENTS
研究得到美国国家科学基金会（MCB-2153410）支持，技术依托LSU基因组学核心设施和佛罗里达大学代谢组学中心完成。