丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的铁硫簇氧化还原特性揭示保守的热力学驱动机制

为解决PFORs（丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶）内部电子传递热力学驱动力的争议，研究人员通过蛋白膜电化学技术比较了来自不同厌氧生物的四种PFORs的铁硫簇氧化还原电位，修正了历史数据并构建了新的电子传递模型。研究发现PFORs的Fe-S簇电位普遍保守（-370至-475 mV vs SHE），且与生理功能无直接关联，而铁氧还蛋白（Fd）结合特性可能主导催化方向。该研究为理解CO2 还原与氧化代谢的调控机制提供了新视角。

　　

在微生物的能量代谢中，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）扮演着关键角色。这类酶能够可逆地催化丙酮酸与CO₂
的相互转化，同时通过铁硫簇（Fe-S）传递电子，为厌氧生物提供还原力或固定碳源。然而，长期以来人们对PFOR催化方向的调控机制存在疑问：为何来自不同代谢途径（如逆向三羧酸循环或硫酸盐呼吸）的PFORs会表现出不同的氧化或还原偏好？更关键的是，此前仅有的铁硫簇氧化还原电位数据来自不完全的氧化还原滴定，且无法区分三个簇的个体电位，这严重制约了对电子传递热力学驱动力的理解。

波士顿大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究中，首次采用蛋白膜电化学（PFE）技术系统比较了四种PFORs（来自Chlorobaculum tepidum、Magnetococcus marinus、Methanosarcina acetivorans和Desulfovibrio africanus）的铁硫簇电位。通过重组表达纯化、酶活测定、铁氧还蛋白偶联实验结合直接电化学分析，发现尽管这些酶来自不同代谢背景，其Fe-S簇电位却惊人地保守（-370至-475 mV），且与生理功能无直接关联。特别值得注意的是，需依赖特定铁氧还蛋白（如MA0431）才能驱动还原反应的发现，暗示催化方向可能由Fd结合特性而非铁硫簇自身电位决定。

关键技术包括：1）重组表达系统构建（E. coli BL21(DE3) ΔiscR）；2）蛋白膜电化学测定铁硫簇电位；3）电子顺磁共振（EPR）验证还原状态；4）耦联酶法检测CO₂
还原活性；5）紫外-可见光谱监测[4Fe-4S]簇氧化状态。

【表达与表征】重组表达的Ct、Mm和Da PFORs均含12个铁原子/二聚体，UV-Vis显示420 nm特征峰，经Eu(II)-DPTA（-1.14 V）完全还原后呈现EPR信号。电化学分析揭示三组Fe-S簇电位：Ct PFOR（-370/-410/-475 mV）、Mm PFOR（-375/-415/-470 mV）和Ma PFOR（-385/-430/-475 mV），均比历史报道的Da PFOR电位（-400/-450/-505 mV）高约50 mV。

【酶活特性】氧化活性测定显示Ma PFOR的k_cat
/K_M
最高（1.76×10⁶
M^-1
s^-1
），而还原实验发现Ct和Mm PFOR需配合Ct Fd1（-511/-570 mV），Ma PFOR则依赖更高电位的Ma Fd1（-345/-375 mV）才能驱动CO₂
还原，说明Fd选择性与酶源匹配。

【电位归属】通过分离Ma PFOR的PorD亚基（含远端和中间簇），明确其两个电位（-455/-530 mV）分别对应全酶中的最高和最低电位，结合文献推测中间簇（-375 mV）作为电子陷阱，在CoA结合前暂存电子。

这项研究颠覆了"铁硫簇电位决定催化方向"的传统认知，提出三个重要结论：1）PFORs的Fe-S簇电位在进化中高度保守，差异仅约15 mV；2）Da PFOR因独特的VII结构域屏蔽效应使其电位整体偏低50 mV；3）铁氧还蛋白结合能（而非铁硫簇自身电位）可能是调控CO₂
还原/氧化平衡的关键因素。该发现不仅为理解古老代谢酶的电子传递机制提供了新范式，也为设计人工碳固定系统提供了理论依据——通过工程化Fd-PFOR相互作用可能比改造铁硫簇更有效实现催化方向调控。