1,3-丁二炔刚性连接体与五元杂环柔性连接体构建的双核苷类核糖核酸酶A抑制剂的合成与活性研究

本研究针对核糖核酸酶A（RNase A）的抑制难题，设计合成了一类以1,3-丁二炔为刚性连接体和五元杂环为柔性连接体的新型双核苷抑制剂。通过动力学实验和分子对接分析，发现刚性连接的bisuridine 11抑制活性最佳（Ki =29.17±0.8 μM），揭示了刚性连接体在酶亚位点结合中的优势，为靶向RNase A及相关酶的药物开发提供了新思路。

　　

核糖核酸酶A（RNase A）作为RNA代谢的关键酶，其异常活性与多种疾病相关。尽管该酶的催化机制已被阐明——依赖His12和His119的双酸碱催化系统完成RNA的磷酸二酯键水解，但针对其特异性抑制剂的开发仍面临挑战。现有抑制剂多存在选择性差或难以同时靶向多个亚位点（如P₁
、B₁
、B₂
）的问题。尤其值得注意的是，先前发现的抑制剂如3′-N-piperidine-4-carboxyl-3′-deoxy-ara-uridine仅能结合外周B₂
亚位点，无法有效阻断核心催化位点。这一现状促使研究人员探索新型抑制剂设计策略，通过刚性/柔性连接体精确调控双核苷的空间排布，以实现对RNase A多亚位点的协同抑制。

来自印度理工学院卡拉格普尔分校的研究团队在《Carbohydrate Research》发表的研究中，创新性地采用1,3-丁二炔作为刚性连接体，并以其为前体衍生出噻吩、异恶唑等五元杂环柔性连接体，构建了系列双核苷化合物。通过Eglinton偶联、Click化学等关键技术，合成了包括bisuridine 11在内的19个目标分子。采用琼脂糖凝胶电泳、沉淀实验进行初筛，结合稳态动力学分析（以2′,3′-cCMP为底物）和分子对接技术，系统评估了这些化合物的抑制活性与作用机制。

合成与结构特征
研究首先通过Cu(OAc)₂
催化的Eglinton偶联反应，将N-炔丙基胸苷1转化为1,3-丁二炔连接的刚性二聚体2。进一步通过环化反应构建噻吩（化合物5）、异恶唑（化合物9）等柔性连接体。值得注意的是，在5′位引入异烟酸酯基团（化合物11）显著增强了与酶亚位点的相互作用。

抑制活性分析
定量实验显示，刚性连接的bisuridine 11表现出最强抑制活性（K_i
=29.17±0.8 μM），较柔性连接体化合物活性提高3-5倍。Lineweaver-Burk双倒数作图表明所有抑制剂均为竞争性抑制模式。分子对接揭示：1,3-丁二炔的线性结构使11能同时占据B₁
和P₀
亚位点，其尿嘧啶基团与Thr45形成氢键网络；而柔性连接体因构象可变性导致结合方向偏离最优取向。

讨论与意义
该研究首次证实：1）刚性1,3-丁二炔连接体能精确固定双核苷的空间构象，更有效覆盖RNase A的多个亚位点；2）连接体刚性-活性关系呈现明显正相关性，这为"构象限制"策略在酶抑制剂设计中的应用提供了新证据。相较于既往报道的1,2,3-三唑连接双糖（K_i

100 μM）或氨基酸缀合物，本研究的bisuridine 11将抑制效率提高了近一个数量级。这些发现不仅为RNase A抑制剂的优化指明了方向，其"刚性连接体增强多靶点协同结合"的设计理念，还可拓展至其他需要同时靶向多个亚位点的酶抑制剂开发中，如HIV逆转录酶或PARP家族蛋白。

研究局限性在于尚未解析抑制剂-酶复合物晶体结构，未来需通过X射线衍射（如借鉴PDB 2G8R的解析方法）验证对接预测。此外，鉴于RNase家族在血管生成（angiogenic）和免疫调节中的作用，这些双核苷化合物在抗肿瘤或抗感染领域的应用价值值得进一步探索。