小鼠品系依赖性精子冷冻保存：-80°C对精子完整性和生育力的差异化影响

推荐：本研究针对传统液氮(LN2 )冷冻保存技术的局限性，系统评估了-80°C冷冻对6种小鼠品系(129/SvImJCnrm、B6J、B6N、BALB/c、CD-1、FVB)精子完整性和IVF(体外受精)率的影响。研究发现129、B6N、CD-1和FVB品系精子可在-80°C保存1年而不影响生育力，而B6J和BALB/c精子则出现显著损伤。该成果为简化基因工程小鼠保种技术提供了重要依据。

　　

在生物医学研究中，基因工程小鼠是至关重要的模型生物，而精子冷冻保存技术则是保种和运输的核心手段。传统方法依赖液氮(LN₂
)保存系统，不仅成本高昂，还存在安全隐患和运输限制。更棘手的是，不同品系小鼠精子对冷冻损伤的敏感性存在显著差异，这使得建立普适性冷冻方案面临巨大挑战。此前虽有研究尝试用-80°C替代LN₂
，但缺乏系统性评估，特别是对多种常用品系的比较研究。

为解决这一难题，Consiglio Nazionale delle Ricerche-European Mouse Mutant Archive的研究团队在《Theriogenology》发表了一项突破性研究。他们首次系统比较了6种常用小鼠品系(129/SvImJCnrm、C57BL/6JCnrm、C57BL/6NTacCnrm、BALB/cByJCnrm、Crl:CD1(ICR)、FVBN/JCnrm)精子在-80°C长期保存后的功能变化。研究采用多维度评估体系，包括IVF率、胚胎发育、流式细胞术检测精子活力、计算机辅助精液分析(CASA)、形态学观察和透射电镜超微结构分析。

关键技术方法包括：1) 使用含18%棉子糖、3%脱脂乳和477μM α-单硫代甘油的冷冻保护剂；2) 通过IVF评估生育力，采用改良HTF培养基(含1mM GSH和5.14mM Ca²⁺
)；3) 流式细胞术结合SYBR 14/PI双染色检测精子存活率；4) Hamilton Thorne IVOS系统分析精子运动参数；5) 透射电镜观察精子超微结构损伤。

研究结果揭示：
《4.1. 体外受精率》
129、B6N、CD-1和FVB品系在-80°C保存12个月后IVF率与LN₂
组无差异，而B6J和BALB/c分别从6个月和3个月开始显著下降。B6J在12个月时IVF率降至对照组的70%，BALB/c更骤降至16.1±2.2%。

《4.2. 胚胎发育》
所有品系的2细胞胚胎发育至囊胚的比例均不受冷冻温度影响，表明-80°C保存不影响胚胎后续发育潜能。

《4.3. 精子存活率》
流式检测显示B6J和BALB/c在-80°C保存后死精比例显著增加，12个月时分别达76%和57%，且与IVF率呈显著负相关(R²
=0.74)。

《4.4. 精子运动力》
所有品系在-80°C保存1个月后总运动力即下降40%，其中B6N从24%降至12%。但该参数在后续保存期间保持稳定，提示运动力损伤主要发生在冷冻阶段而非保存过程。

《4.5. 精子形态》
-80°C保存12个月使所有品系异常精子比例增加，BALB/c异常率最高(53.3%)且以头部畸形为主(>20%)，其他品系则以尾部异常为主。

《4.6. 超微结构》
透射电镜显示-80°C保存1个月即导致所有品系出现Ⅲ级损伤(质膜破裂/线粒体嵴消失)，BALB/c在12个月时损伤率达95.8%，远高于B6N的54.5%。

这项研究首次全面阐明了-80°C冷冻对不同遗传背景小鼠精子的差异化影响。其重要意义在于：1) 确立了129、B6N、CD-1和FVB品系可采用-80°C替代LN₂
长期保存的方案，大幅降低保种成本；2) 揭示B6J和BALB/c精子对-80°C特别敏感，为这些品系保存提供了预警指标；3) 发现精子运动力损伤主要发生在冷冻阶段，而形态异常随保存时间累积，为优化冷冻程序指明方向。研究团队建议对敏感品系探索-152°C保存方案，这或将彻底革新基因工程小鼠资源保藏策略。