多价SARS-CoV-2病毒样颗粒疫苗候选物的开发与免疫原性研究：基于昆虫细胞表达系统的色谱纯化策略

为解决现有COVID-19疫苗对变异株保护力不足的问题，研究人员开发了包含SARS-CoV-2四种结构蛋白(SEMN)的冠状病毒样颗粒(CoVLP)疫苗。通过昆虫细胞表达系统和新型羟基/阳离子交换整体柱色谱技术，实现了高纯度CoVLP的规模化纯化。动物实验显示该疫苗能诱导强效中和抗体(1234 IU/mL)和Th1型免疫应答，为应对疫苗逃逸突变提供了新策略。

　　

在全球抗击COVID-19疫情的战役中，疫苗研发始终面临两大挑战：一是病毒持续变异导致现有疫苗效力下降，二是单纯依赖刺突蛋白(Spike, S)的疫苗难以提供全面保护。截至研究开展时，SARS-CoV-2已感染超7亿人，造成700万人死亡。尽管mRNA和病毒载体疫苗在短期内取得突破，但病毒在S蛋白上积累的逃逸突变使疫苗效果大打折扣。更棘手的是，传统密度梯度离心法难以满足规模化生产需求，而现有纯化技术又无法有效分离病毒样颗粒(VLP)与杆状病毒载体。

针对这些瓶颈问题，来自斯洛文尼亚的研究团队在《Vaccine》发表了一项创新研究。他们开发了包含S、E、M、N四种结构蛋白的冠状病毒样颗粒(CoVLP)疫苗，通过昆虫细胞表达系统和新型色谱纯化工艺，成功制备出形态与天然病毒高度相似的纳米颗粒。更重要的是，这种多价疫苗在小鼠体内诱导了针对S和N蛋白的强效免疫应答，中和抗体滴度达到1234 IU/mL，为开发"防变异"疫苗提供了新思路。

研究采用了几项关键技术：利用bac-to-bac系统构建重组杆状病毒，在Sf9昆虫细胞中表达SEMN/SEM复合体；开发基于CIMmultus OH疏水相互作用和SO3阳离子交换的整体柱色谱纯化流程；通过纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)表征颗粒特性；使用AddaVax佐剂配伍进行小鼠免疫实验，并通过ELISA和病毒中和试验评估免疫效果。

【2.1. Production of CoVLPs in insect cell culture】
研究人员巧妙改造了S蛋白结构：用蜜蜂蜂毒肽(HMB)信号肽替换天然序列，引入T1273A突变促进高尔基体滞留，并采用K986P/V987P双突变稳定预融合构象。Western blot显示感染后48小时即可检测到CoVLP分泌，第4天收获时产量达到峰值。这种基因设计确保了S蛋白与M蛋白的有效互作，显著提高了颗粒组装效率。

【2.2. Chromatographic purification of SEM and SEMN particles】
创新性的两步色谱纯化是研究亮点。首先利用1.5 M磷酸钾条件下羟基柱(HIC)捕获颗粒，NTA分析显示SEMN颗粒(80-180nm)与杆状病毒(180-600nm)形成明显区分。随后阳离子交换(CEX)进一步纯化，使杆状病毒清除率达到3.2 log。值得注意的是，含N蛋白的SEMN颗粒(平均164nm)比SEM颗粒(148nm)更大，这与天然病毒结构特征相符。

【2.3. Purfied CoVLP vaccine is immunogenic in mice】
免疫原性实验结果令人振奋：50μg剂量配合AddaVax佐剂腹腔免疫后，SEMN组抗S抗体滴度在首针后即达峰值，而抗N抗体在加强免疫后显著升高。透射电镜证实纯化颗粒具有典型冠状病毒形态，表面S蛋白冠突清晰可见。特别重要的是，SEMN诱导的IgG2a/IgG1比值高达9:1，显示强烈Th1偏向性免疫，这与含N蛋白的灭活疫苗特性一致。

【2.4. Robust neutralization potential of CoVLPs】
中和试验数据最具说服力：针对B.1.1.1毒株，SEMN组中和滴度(1234±772 IU/mL)显著高于SEM组(759±234 IU/mL)，达到ChAdOx1-S载体疫苗水平。这表明N蛋白的加入不仅拓宽了抗原谱，还可能通过RNA复合物激活RIG-I通路，增强细胞免疫应答。

在讨论部分，作者强调该研究突破了传统密度梯度离心的技术限制，建立了可放大的色谱纯化平台。虽然残留杆状病毒(约10⁶
PFU/mL)仍需优化，但已符合疫苗安全标准。多价抗原设计尤其值得关注：N蛋白的加入不仅增强免疫原性，其介导的Th1极化可能降低疫苗相关增强疾病风险——这正是SARS疫苗研发中长期关注的难题。研究者建议未来可尝试与CpG等TLR激动剂配伍，进一步优化免疫应答。

这项研究的意义在于：首次将整体柱色谱技术应用于CoVLP规模化生产；证实多价抗原设计能诱导更全面的免疫保护；为应对不断出现的变异株提供了技术储备。随着COVID-19进入常态化防控阶段，这种能模拟天然病毒感染、覆盖多保守表位的疫苗策略，或将成为下一代疫苗开发的重要方向。