KREMEN1变异导致外胚层发育不良的分子机制：糖基化缺陷与WNT信号通路失调

推荐：本研究针对KREMEN1变异如何引发外胚层发育不良（ED）这一科学问题，通过构建KREMEN1蛋白变异体，结合糖基化分析和共免疫沉淀实验，揭示了变异导致O-糖基化减少及KREMEN1-DKK1-LRP6三元复合物形成受损的机制。患者原代成纤维细胞实验进一步证实WNT/β-catenin通路基础活性增强但WNT3A响应减弱，为ED的靶向治疗提供了新思路。

　　

外胚层发育不良（Ectodermal Dysplasia, ED）是一类以毛发、牙齿、指甲和腺体发育缺陷为特征的遗传异质性疾病，其致病基因涉及多个信号通路。近年来，WNT/β-catenin通路的核心调控因子KREMEN1被确定为ED的新致病基因，但变异如何影响其功能尚不明确。更棘手的是，临床患者常表现为严重的牙齿缺失（如少牙症）伴轻度外胚层特征，而传统治疗仅能缓解症状。这一领域亟待揭示KREMEN1变异的分子机制，为精准干预提供依据。

针对这一挑战，来自中国的研究团队在《Journal of Investigative Dermatology》发表重要成果。他们发现两名埃及裔姐妹和一名德国男性患者携带新型纯合KREMEN1变异（c.136C>T无义变异和c.497G>A错义变异），均表现为少牙症和毛发稀疏等典型ED症状。为解析机制，团队通过构建Flag标签的KREMEN1野生型及变异体（Cys111Ser、Gly166Asp等），结合糖基化酶处理、共免疫沉淀和患者原代成纤维细胞培养，系统评估了变异对蛋白修饰、复合物形成及WNT通路活性的影响。

主要技术方法
研究采用全外显子测序鉴定患者变异，通过Sanger测序验证；利用HEK293T细胞过表达KREMEN1变异体，通过PNGase F和蛋白去糖基化混合酶分析糖基化状态；采用抗HA磁珠共免疫沉淀检测KREMEN1-DKK1-LRP6三元复合物；从患者皮肤活检获取原代成纤维细胞，通过qPCR定量AXIN2 mRNA水平评估WNT通路活性。

研究结果

KREMEN1蛋白变异显著减少O-糖基化
免疫印迹显示，野生型KREMEN1存在约70 kDa核心条带和更高分子量的糖基化拖尾，而变异体（如Cys111Ser）的拖尾信号减少60%-87%。去糖基化实验证实，变异主要损害O-糖基化而非N-糖基化，提示变异可能通过改变蛋白构象影响功能。

三元复合物形成能力受损
在DKK1存在下，所有变异体与LRP6的结合未受影响，但DKK1共沉淀量降低2-3倍（p<0.01）。这表明变异特异性破坏KREMEN1-DKK1-LRP6三元复合物形成，而KREMEN1-LRP6二元相互作用保留，与结构学中CUB域（负责LRP6结合）和Kringle-WSC模块（介导DKK1结合）的功能分区一致。

患者细胞显示WNT通路动态失调
与原代对照相比，患者成纤维细胞在饥饿状态下AXIN2表达升高1.5-2.2倍（p<0.05），提示基础通路活性增强。然而，WNT3A刺激后，患者细胞的AXIN2上调幅度（7.9-8.4倍）显著低于对照组（13.7-13.9倍，p<0.01），反映信号响应能力减弱。这种“高基线-低响应”模式暗示KREMEN1变异导致通路调控失衡。

结论与意义
该研究首次阐明KREMEN1变异通过双重机制导致ED：一是O-糖基化缺陷破坏蛋白构象，削弱其与DKK1的协同作用；二是引发WNT通路“失调稳态”——基础活性升高但可塑性下降。这一发现不仅解释了ED患者组织特异性表型（如牙齿发育严重受损），还为开发靶向糖基化或通路平衡的治疗策略提供了理论依据。此外，研究建立的成纤维细胞模型为未来药物筛选提供了可靠平台。

值得注意的是，患者细胞中WNT靶基因（如RNF43/ZNRF3）的反馈调节可能被扰乱，这为理解KREMEN1在更广泛发育过程中的作用开辟了新方向。团队强调，需进一步探索不同组织对KREMEN1功能丧失的敏感性差异，以推动临床转化。